TY  - THES
T1  - Molekulare Evolution der Pyranose-2-Oxidase aus Peniophora gigantea zur effizienten Anwendung in der Biokatalyse
A1  - Dorscheid,Susanne
Y1  - 2009/06/16
N2  - Die Pyranose-2-Oxidase aus Peniophora gigantea lag zu Beginn dieser Arbeit in E. coli kloniert vor und trug die Austausche E540K und K312E. Durch gerichtete Evolution in Kombination mit rationalem Design konnte die katalytische Effizienz dieser Variante durch Einführen der Austausche N71Y und S456N für das Substrat 2-Desoxy-D-glucose um das 30,3-fache erhöht werden. Ein rationales Design im aktiven Zentrum an Position T169 zur Verbesserung der Affinität zu D-Galactose hatte eine Variante mit 4,9-fach erhöhter katalytischer Effizienz zum Zielsubstrat zur Folge. Außerdem besaß die T169G eine 62-fach erhöhte katalytische Effizienz für LArabinose, welche ebenfalls ein sehr interessantes Substrat darstellt. Durch Austausch hydrophober Aminosäuren in der stark exponierten Kopfregion des Enzyms wurde die Bildung von inclusion bodies um 38% gesenkt und eine vielseitige und stabile Variante entwickelt (P2OxB2H1). Eine Coexpression mit dem Triggerfaktor aus E. coli bewirkte eine weitere Verbesserung auf 7,5%. Daneben konnte die Enzymausbeute durch Etablierung eines Verfahrens zur Hochzelldichtefermentation von E. coli um das 12,7-fache auf 6333 U/L gesteigert werden. Durch MALDI TOF-Analyse von Pepsin-fragmentierter P2Ox vor und nach Biokonversion wurde ein oxidationsanfälliges Methionin isoliert und per Sättigungsmutagenese durch Glutamin ersetzt. Die neue Variante wies eine höhere operative Stabilität auf und blieb auch bei Einsatz in mehreren aufeinanderfolgenden Konversionen aktiv.
KW  - Rekombinantes Protein
KW  - Proteindesign
KW  - Proteine
KW  - Biokonversion
KW  - Biokatalyse
CY  - Saarbrücken
PB  - Universitäts- und Landesbibliothek
AD  - Postfach 151141, 66041 Saarbrücken
UR  - http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2009/2193
ER  -