TY  - THES
T1  - In vivo Topologie und Lokalisation des zellulären HDEL-Rezeptors Erd2p und dessen Funktion bei der Endozytose desviralen K28-Toxins in Hefe
A1  - Dausend,Julia
Y1  - 2011/03/29
N2  - K28, ein viral kodiertes A/B-Toxin von Killerstämmen der Hefe Saccharomyces cerevisiae tötet sensitive Zielzellen durch Inhibierung der DNA-Synthese, Arretierung des Zellzyklus und Induktion der Apoptose. Die Aufnahme erfolgt in einem zweistufigen, rezeptorvermittelten Prozess über die Zellwand und die Plasmamembran. Das Toxin durchläuft den Sekretionsweg retrograd und wird Heterodimer in das Zytosol disloziert. Die α-Untereinheit entfaltet im Nukleus ihre Toxizität, während die β-Untereinheit ubiquitiniert und proteasomal abgebaut wird. Die Schlüsselrolle im retrograden Transport von K28 nimmt der HDEL-Rezeptor Erd2p ein. Frühere Experimente deuteten auf eine Funktion von Erd2p als Sekundärrezeptor des Toxins auf Ebene der Plasmamembran hin. In der vorliegenden Arbeit wurde der HDEL-Rezeptor der Hefe S. cerevisiae auf seine zelluläre Lokalisation, Struktur und Funktion untersucht, um den Mechanismus der Erd2p-vermittelten Endozytose von K28 aufzuklären. Die Lokalisation von Erd2p wurde mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning- Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Als zweites Nachweissystem wurde ein nach dem "RAS recruitment"-System modifizierter, wachstumsbasierter Plasmamembran-Lokalisationsreporter zur Anwendung gebracht. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse eine Kolokalisation von Erd2p in ER- und Golgi-Kompartimenten sowie in der Plasmamembran. Zur Topologie-Analyse von Erd2p wurde eine in silico Vorhersage mit drei in vivo Topologie-Reportern kombiniert. Die Fusionsproteine aus verkürzten Erd2p-Varianten mit dem C-terminalen Wachstumsreporter RAS für die zytosolische Orientierung, mit dem Glykosylierungsreporter SUC2AV5 für die luminale Orientierung und mit dem wechselseitigen, redoxsensitiven Reporter ro2GFP bestätigten eine Nin - Cin-Topologie von Erd2p mit sechs Transmembranhelices. Über Mutagenese wurden Erd2p-Rezeptor-Varianten ohne potentielle Endozytosemotive hergestellt. Diese Varianten waren in der Lage, den Verlust der chromosomalen ERD2-Kopie funktionell zu komplementieren. Die Deletion des N-terminalen NPF-Signals in Erd2p führte zu einem Sensitivitätsverlust gegen K28 und weist auf eine untergeordnete Funktion in der Endozytose der Erd2p/K28-Komplexe hin. Aus dem Ersetzen aller vier Lysinreste innerhalb des zytosolischen C-terminalen Lysin-Clusters geht ein funktioneller Erd2p-Rezeptor hervor, der jedoch nicht mehr in der Lage ist, eine endozytotische K28-Aufnahme zu vermitteln. Im Zusammenhang mit der Bestätigung der Erd2p/Rsp5p- Interaktion in der BiFC-Analyse belegen diese Ergebnisse die Notwendigkeit einer signalgebenden Ubiquitinierung von Erd2p für die Endozytose von K28. Art-Proteine können die Aufgabe von Adaptern zwischen der Ubiquitin-Ligase Rsp5p und ihren Substraten an der Plasmamembran übernehmen. Die verminderte Sensitivität von Δart2, Δart8 und Δart9-Mutanten gegen K28 liefert einen Hinweis, dass die Interaktion von Erd2p und Rsp5p über die redundanten Art-Proteine vermittelt wird.
KW  - Endocytose
KW  - Rezeptor
KW  - Bäckerhefe
KW  - Topologie
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