TY  - THES
T1  - Molekulare Evolution von Dehydrogenase-Varianten zur Herstellung enantiomerenreiner Feinchemikalien
A1  - Gauer,Sabrina
Y1  - 2011/12/23
N2  - Da die LSDH-Aktivität der 1993 isolierten Stenotrophomonas-Spezies im Zuge der Archivierung verloren ging, wurden erneut Bodenbakterien auf LSDH-Aktivität gescreent. Ein neu isolierter Bodenorganismus (K5) zeigte ebenfalls LSDH-Aktivität. Aufgrund zu geringer Aktivität der K5-LSDH wurde ein weiteres Enzym mit LSDH-Aktivität gesucht. Der N-Terminus des Stenotrophomonas-Enzyms wies hohe Übereinstimmung zur Ribitol-2-DH aus B. japonicum USDA110 auf. Das entsprechende Gen wurde in einen Expressionsvektor kloniert und heterolog exprimiert. Das resultierende Protein besteht aus 243 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 26 kDa je Untereinheit. Die spezifischen Aktivitäten des reinen Enzyms für L- und D-Sorbitol sind 0,1 U/mg bzw. 115 U/mg. Die Km-Werte für L- und D-Sorbitol liegen bei 13,6 mM bzw. 12,7 mM. Biochemische Daten identifizieren das Enzym als Trimer. Bei einem Umsatz mit dem Substrat L-Sorbitol entsteht der seltene Zucker D-Sorbose. Das Temperaturoptimum der LSDH liegt bei etwa 55°C. Als stabilisierende Aminosäuren konnten C68 und M228 identifiziert werden.
Die Stabilität der GatDH konnte durch rationales Design und durch das Einführen neuer Disulfid-Brücken am Dimer-Dimer-Interface leicht gesteigert werden. Verbesserte Varianten sind A57E, A58R und Q168M.
Weitere Modellenzyme für das Projekt ERUDESP, die in dieser Arbeit heterolog exprimiert und charakterisiert wurden waren die DMDH aus L. lactis, die LMDH aus P. putida und die Diaphorase aus C. kluyveri. 
KW  - Dehydrogenasen
KW  - Proteindesign
KW  - Feinchemikalie
KW  - Zuckergewinnung
CY  - Saarbrücken
PB  - Universitäts- und Landesbibliothek
AD  - Postfach 151141, 66041 Saarbrücken
UR  - http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2011/4536
ER  -