TY  - THES
T1  - Identifizierung essentieller Komponenten des intrazellulären Transports eines viralen A/B-Toxins der Hefe
A1  - Sendzik,Tanja
Y1  - 2007/03/07
N2  - Die Hefe Saccharomyces cerevisiae sezerniert das von dsRNA Viren kodierte, heterodimere K28-Toxin in das sie umgebende Medium und ist somit in der Lage, Hefen derselben oder einer anderen Gattung abzutöten. Der als Präprotoxin (pptox) vorliegende Toxinvorläufer wird posttranslational in das ER-Lumen transportiert und nach Abspaltung der Signalsequenz werden die beiden Untereinheiten des reifen Toxins, α und β, durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Die Toxinaufnahme durch sensitive Zielzellen erfolgt über rezeptorvermittelte Endozytose, an deren Anschluss K28 retrograd über Golgi und ER bis auf die Stufe des Zytosols transportiert wird. Die Retrotranslokation aus dem ER erfolgt über den Sec61-Komplex der ER-Membran. Im Zytosol dissoziiert das α/β-Heterodimer in seine Toxinuntereinheiten, β wird ubiquitiniert und proteasomal abgebaut, während die zytotoxische α-Komponente mittels passiver Diffusion in den Zellkern gelangt und einen Zellzyklusarrest am G1/S-Übergang induziert. In der vorliegenden Arbeit wurden vier Themenschwerpunkte bearbeitet, die sich mit der intrazellulären Expression toxischer K28α-Derivate und deren intrazellulären Transportroute beschäftigten.
(1) Im Rahmen einer Transposon(mTn3)-Mutagenese konnten überwiegend nicht-essentielle Hefeproteine als potentielle Interaktionspartner der beiden toxischen α-Varianten α(SS/R) und α(NLS/R) identifiziert werden: APL3, CWP2, IRA2, PFK26, PRP6, RNH203 und ZWF1. Die toxischen α-Varianten wurden in den jeweiligen knock-out-Mutanten der betreffenden Gene intrazellulär exprimiert und zusätzlich gegen exogen appliziertes K28-Toxin getestet. Es stellte sich heraus, dass die beiden Proteine Prp6p und Apl3p potentielle Interaktionspartner von α darstellen könnten. Das Gen PRP6 wurde anhand des Konstruktes α(NLS/R)identifiziert. PRP6 kodiert den RNP(U4/U6)-assoziierten Spleißfaktor Prp6p, der am prä-mRNA-Spleißen beteiligt ist und sich in der Kernmatrix befindet. Prp6p könnte somit mit K28α im Kern in direkte Wechselwirkung treten, was die Theorie des Kernimportes unterstützt. Die Mutation des Genes ist letal, weshalb das Protein nicht weiter untersucht wurde, da keine Expressionsstudien damit durchgeführt werden konnten. Des Weiteren wurde mit α(NLS/R) das Gen APL3 identifiziert, was einen Hinweis auf einen gerichteten Kernimport von K28α lieferte. Bei Apl3p handelt es sich um einen Teil des an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligten AP2-Komplexes. Apl3p durchläuft ein nukleoplasmatisches "Shuttling". Auf dem Weg in den Zellkern könnte es mit der α-Untereinheit interagieren und eventuell dessen Import in den Nukleus erleichtern; alternativ wäre eine Interaktion nach passiver Diffusion von α(NLS/R) im Nukleus möglich. Interessanterweise verhielt sich die Δapl3-Mutante auch resistent gegen exogen appliziertes Toxin. Diese Resistenz beruht jedoch nicht auf einem Defekt der endozytotischen Toxin-Aufnahme (das Toxin war im Zytosol nachweisbar), sondern manifestiert sich vermutlich weiter "downstream", da sich die Mutante auch resistent gegen die Expression von α(SS/R) im ER verhielt.
(2) Mit Hilfe eines Mutanten-Screenings konnte untermauert werden, dass α(SS/R) in den Sekretionsweg der Zelle eingeschleust wird und die Signalpeptidaseaktivität im ER eine entscheidende Rolle für die Retrotranslokation und Toxizität spielt. Darüber hinaus wurden deutliche Hinweise dafür erbracht, dass α(SS/R) bis auf die Stufe des Golgi gelangt und anschließend wieder retrograd zum ER transportiert wird, was aus der Resistenz der Mutanten Δkex1, Δerv29, Δerv46, Δerv41, Δemp24, Δemp46 und Δbst1 nach intrazellulärer Expression von α(SS/R)gezeigt werden konnte. Zwei Möglichkeiten sind somit beim intrazellulären Transport der α-Untereinheit denkbar: α wird nach Erreichen des Golgi wieder retrotransportiert und aus dem ER in das Zytosol transloziert; im Zytosol angekommen, erfolgt eine passive Diffusion in den Kern, der eventuell eine Interaktion von α mit zytosolischen Proteine vorausgeht. Hinweise darauf lieferten die Nukleoporinmutanten Δnup60, Δnup84 und Δgfd1, die nach intrazellulärer Expression von α(SS/R) und α(NLS/R) resistent waren oder lediglich ein leicht verzögertes Wachstum zeigten. Eine weitere Alternative wäre, dass α im Fall von α(SS/R) direkt vom Golgi das Zytosol erreicht. 
(3) Der intrazelluläre Nachweis der K28α-Untereinheit konnte erstmals anhand einer cmyc-markierten Toxinvariante (α(R)cmyc) erbracht werden. Die in vivo toxischen Varianten α(SS/R)cmyc und α(NLS/R)cmyc wurden weder im Zellaufschluss noch im Kulturüberstand nachgewiesen. Die durchgeführten Versuche ließen in Übereinstimmung mit den Mutantenanalysen den Schluss zu, dass α(SS/R) in den Sekretionsweg geschleust werden muss, um seine toxische Wirkung entfalten zu können; α(NLS/R) hingegen gelangt aufgrund der NLS direkt in den Kern; übereinstimmend hiermit war α(R) nicht mehr toxisch. (4) Der Austausch aller Lysinreste innerhalb von K28pptox gegen Arginine lieferte K28—Derivate mit einer verminderten Sekretionsrate und einer dadurch bedingten verminderten Toxizität. Die Lysin-freien Varianten waren jedoch in der Lage, den Zellen eine protektive Immunität zu verleihen. Eine Erhöhung der Toxizität war in den K-0 Varianten von K28 nicht zu beobachten, so dass eine Ubiquitinierung bei der Vermittlung der Toxizität keine Rolle spielt.
KW  - Saccharomyces cerevisiae
KW  - Hefeartige Pilze
KW  - Intrazellulärer Transport
KW  - Toxin
KW  - Ubiquitin
KW  - Endocytose
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UR  - http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2007/912
ER  -