TY  - THES
T1  - Cortisolproduktion in Schizosaccharomyces pombe : eine Analyse verschiedener Varianten des CYP11B1 Enzyms
A1  - Zearo,Silvia
Y1  - 2007/02/13
N2  - Cortisol und Aldosteron, gehören zu den Corticosteroiden und werden in der Nebennierenrinde synthetisiert. Beim Menschen werden die finalen Schritte der Cortisol- und Aldosteronsynthese durch CYP11B1 und CYP11B2 katalysiert. CYP11B1 katalysiert die 11β-Hydroxylierung von 11-Desoxycortisol (RSS) zu Cortisol. Aufgrund der mannigfaltigen physiologischen Aufgaben des Cortisols bei der Gluconeogenese, dem Fettabbau, dem Flüssigkeits- und Mineralstoffhaushalt sowie der Immunantwort, ist die Regulation seiner Synthese auf molekularer Ebene von großem wissenschaftlichem Interesse. Darüber hinaus besteht aufgrund des hohen Bedarfs in der Medizin die Notwendigkeit, Cortisol schnell und kostengünstig zu produzieren. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die enzymatische Cortisolproduktion durch die Entwicklung einer oder mehrerer gentechnisch veränderter Varianten des CYP11B1 mit einer erhöhten enzymatischen Aktivität zu optimieren. Darüber hinaus sollten neue Erkenntnisse über die Regulation der Aktivität des CYP11B1 auf molekularer Ebene generiert werden.
Da CYP11B1 und CYP11B2 an die innere Mitochondrienmembran gebunden sind, gestaltet sich sowohl ihre Kristallisierung als auch eine weiterführende in vitro Analytik schwierig. Deshalb wurde mit dem Hefepilz S. pombe ein modernes, gut geeignetes in vivo System für die Umsetzung des geplanten Vorhabens eingesetzt. Außerdem besitzt S. pombe mit dem electron transport protein 1 (etp1) ein Protein, dessen C-Terminus dem natürlichen Redoxpartner des CYP11B1, Adrenodoxin (Adx), in Struktur und Funktionalität sehr ähnlich ist. Um die Auswirkungen mehrerer natürlicher und artifizieller Enzyme auf die Cortisolsynthese zu untersuchen, wurden eine Reihe von verschiedenen CYP11B enthaltenden Plasmiden generiert. Dabei wurden zum einen durch ortsgerichtete Mutagenese in funktionell relevanten Strukturdomänen diverse Mutanten des humanen CYP11B1 im pCAD1 Plasmid generiert. Die Auswahl potentiell interessanter Positionen in der Aminosäuresequenz erfolgte auf der Basis von Erkenntnissen über bereits bekannte Mutationen sowie von Computer-gestützten Modellen des Enzyms. Zum anderen wurden CYP11B cDNAs aus Mensch, Affe, Rind, Ratte und Meerschweinchen amplifiziert und in den pNMT1-TOPO Vektor kloniert. Mit diesen Plasmiden wurden Hefe Zellen transformiert und neue S. pombe Stämme generiert. In den so erzeugten Hefestämmen wurde dann die Proteinexpression mittels Western Blot und die enzymatischen Aktivität durch den Umsatz des Substrates RSS zu Cortisol gemessen. 
Mittels Western Blot konnte die erfolgreiche Expression der entsprechenden CYP11B Varianten in allen generierten Stämmen nachgewiesen werden. Die Enzyme der ortsgerichteten Mutagenese wurden in verschiedene Gruppen eingeteilt, die wichtige strukturelle Regionen für den katalytischen Prozess widerspiegeln. Keine der Varianten mit einer Modifikation im aktiven Zentrum zeigte eine Aktivitätssteigerung. Mutationen im Bereich der Interaktionsstelle mit dem Redoxpartner führten zu inhomogenen Veränderungen der katalytischen Aktivität. Einige Mutanten verloren vollständig ihre enzymatische Aktivität, während bei anderen entweder eine Reduktion oder eine leichte Erhöhung der enzymatischen Aktivität nachweisbar war. Die höchste Aktivität von den durch gerichtete Mutagenese erzeugten Varianten konnte bei den Stämmen SZ1 und SZ78 beobachtet werden. Diese Stämme exprimieren die Enzyme CYP11B1M52LV78I und CYP11B1V78I, welche eine 3,5- bzw. 3fache Erhöhung der Aktivität im Vergleich zum Referenz Stamm zeigten. Diese Mutationen befinden sich in der für die Erkennung und Bindung des Substrates zuständigen Region des Proteins. Die Untersuchung der verschiedenen Tierarten ergab eine deutlich gesteigerte Aktivität des Affenenzyms (Stamm PHB1). Die Aktivität war im Vergleich zum humanen Referenzstamm (HSB1) um das 6,2fache erhöht. Bei den Stämmen SZ1A (CYP11B1M52LV78I mit der mitochondrialen Importsequenz des humanen CYP11B2), SZ1B (CYP11B1M52LV78I mit der Importsequenz des humanen CYP11B1) und HSB2M (hsCYP11B2P112IE147D) lies sich ebenfalls eine leicht erhöhte Aktivität nachweisen. Das Ausmaß der Aktivitätssteigerung bewegte sich zwischen dem 1,5—3fachen von HSB1. Auch in diesen Fällen können Unterschiede im Bereich der Region der Erkennung und Bindung des Substrates als Ursache für die Aktivitätszunahme vermutet werden.
In dieser Arbeit wurden umfangreiche neue Informationen über CYP11B1 generiert, die einen tieferen Einblick in die Beziehung zwischen Struktur und Funktion dieses Enzyms ermöglichen. Insbesondere Mutationen im Bereich der Substratbindungsstelle scheinen besonders viel versprechend für die Generierung von CYP11B1 Varianten mit erhöhter Aktivität zu sein. Zukünftige Untersuchungen müssen diese Erkenntnisse bestätigen und in weiterführenden Experimenten vertiefen.
KW  - Hydrocortison
KW  - Schizosaccharomyces pombe
KW  - Cytochrom P-450
KW  - Mutation
CY  - Saarbrücken
PB  - Universitäts- und Landesbibliothek
AD  - Postfach 151141, 66041 Saarbrücken
UR  - http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2007/961
ER  -