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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-10221
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2007/1022/


TRPV6 und TRPM8: Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen

TRPV6 and TRPM8: Analysis of protein-protein-interactions

Erler, Isabell Christine

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SWD-Schlagwörter: Proteine , Ionenkanal
Freie Schlagwörter (Deutsch): TRPV6 , TRPM8 , Multimerisierung , TRP
Freie Schlagwörter (Englisch): Coiled Coil , Ankyrin Repeats
Institut: Fachrichtung 2.4 - Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät: Fakultät 2 - Medizin
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Flockerzi, Veit (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.02.2007
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 20.02.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Die Proteine der TRP-Familie bilden Kationenkanäle, die an verschiedenen sensorischen und zellbiologischen Prozessen beteiligt sind. Strukturell zeigen sie eine Ähnlichkeit zu den Kaliumkanälen, die eine tetramere Struktur aufweisen. Man nimmt deshalb an, dass sich jeweils vier monomere TRP-Proteine zu einem funktionellen tetrameren Ionenkanal zusammenlagern. Ein tetramerer Aufbau war zu Beginn dieser Arbeit nur für TRPV1 angedeutet worden. Durch welche Interaktionsdomänen eine Multimerisierung vermittelt wird, und ob es phylogenetisch konservierte Signale und Mechanismen dafür gibt, war unbekannt. Da sich aber verschiedene Mitglieder der TRP-Familie hinsichtlich ihrer zytoplasmatischen Proteinmotive stark unterscheiden, liegt die Vermutung nahe, dass ihre Tetramerisierungssignale unterschiedlich sind. In dieser Arbeit wurden Homomultimerisierungsdomänen der beiden Proteine TRPV6 und TRPM8 identifiziert und untersucht und es wurde gezeigt, dass beide Proteine Tetramere bilden können. TRPV6 ist vermutlich an der intestinalen und transplazentalen Resorption von Kalzium beteiligt, TRPM8 spielt wahrscheinlich eine Rolle bei der Kälteperzeption durch das somatosensorische System. Beide Kanäle zeigen außerdem eine verstärkte Expression in malignen Formen des Prostatakarzinoms, und zumindest für TRPV6 scheint die verstärkte Kanalexpression mit einer verstärkten Proliferation zu korrelieren. Das Verständnis der jeweiligen Strukturen und Signale, die den funktionellen Kanal-Zusammenbau vermitteln, würde nicht nur erlauben das Zusammenlagern der TRP-Proteine zu Kanälen zu verstehen, sondern könnte zukünftig auch eine Bedeutung für die Entwicklung neuer Pharmaka haben. Zur Identifizierung und Analyse der Proteindomänen wurden verschiedene Methoden eingesetzt: Die mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System verwandten Systeme Bacteriomatch® und Bacteriomatch®II wurden etabliert, weiterentwickelt und zur Analyse von homo- und heterotypischen Proteininteraktionen angewendet. Außerdem wurden markierte Ionenkanal-Fusionsproteine mit TRPV6 bzw. TRPM8 ko-immunpräzipitiert. Identifizierte Proteindomänen wurden anschließend gezielt mutiert und die mutierten Proteine auf ihre Fähigkeit untersucht, Proteinkomplexe und funktionelle Ionenkanäle zu bilden. Weiter wurden in dieser Arbeit Heteromultimerisierungen von TRPV6 mit anderen Mitgliedern der TRPV-Unterfamilie untersucht. In verschiedenen Experimenten konnte TRPV6 nicht mit TRPV2, TRPV3 und TRPV4 ko-immunpräzipitiert werden. Mit TRPV1 wurde dagegen eine schwache Interaktion beobachtet; TRPV5 wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit war die Suche nach unbekannten Interaktionspartnern von TRPV6. Da zu Beginn dieser Arbeit außer Calmodulin keine mit TRPV6 interagierenden Proteine bekannt waren, sollten neue Proteine, die mit dem TRPV6-Carboxyterminus interagieren, mit einem Bakterien-Zwei-Hybrid-System identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde zuerst eine cDNS-Bibliothek aus humaner Plazenta hergestellt und mit dem Bacteriomatch®-System durchsucht; danach wurde eine cDNS-Bibliothek aus humanem Pankreas von Mensch mit dem Bacteriomatch®II-System durchsucht. Mit beiden Bibliotheken konnten jedoch keine spezifisch interagierenden Proteine gefunden werden.
Kurzfassung auf Englisch: Proteins of the TRP family form cation channels involved in many different sensory and cellular processes. Regarding their structure, they display some similarities to voltage gated potassium channels, which exhibit a tetrameric structure. It is thus assumed that four monomeric TRP proteins assemble to form a functional tetrameric ion channel. At the beginning of this work, a tetrameric structure was postulated only for TRPV1. It was unknown which interaction domains mediate a multimerisation and whether there are conserved signals and mechanisms for TRP channel assembly. The fact that cytoplasmatic protein motifs differ especially between members of different TRP family subgroups leads to the assumption that their tetramerisation signals are different. In the framework of this thesis, homomultimerisation domains of the two TRP proteins TRPV6 and TRPM8 were identified and it was shown that both proteins can form tetramers. TRPV6 is most likely involved in intestinal and placental absorption of calcium, TRPM8 presumably plays a role in cold perception via the somatosensoric system. Both ion channels are overexpressed in malignant forms of prostata cancer, and at least in case of TRPV6, expression of TRPV6 transcripts seems to correlate with enhanced proliferation. Knowledge of structures and signals responsible for the assembly of functional channels would not only permit the understanding of the formation of TRP ion channels, but could also be of interest for the development of new pharmaceuticals. Several methods were used to identify and analyse interacting protein domains: the two systems Bacteriomatch® and Bacteriomatch®II, which are conceptually similar to yeast two hybrid systems were established, refined and applied to analyse homo- and heterotypical protein interactions. Furthermore, tagged ion channel fusion proteins were co-immunoprecipitated with TRPV6 and TRPM8 respectively. After identification, protein interaction domains were mutated by directed point mutagenesis and tested for their ability to form protein complexes and functional ion channels. Moreover, heteromultimerisations of TRPV6 with other members of the TRPV-subfamily were investigated in the course of this thesis. In repeated experiments, TRPV6 could not be co-precipitated with TRPV2, TRPV3 and TRPV4, whereas there was a weak interaction with TRPV1; TRPV5 was not tested. Another aim of this thesis was the identification of unknown proteins interacting with TRPV6. Since there were no known proteins interacting with TRPV6 other than calmodulin when this thesis was started, a screen for new interaction partners with the carboxyterminal region of TRPV6 was performed using a bacterial two hybrid system. For this purpose, a cDNA library was synthesized from human placenta and screened by using the Bacteriomatch®-System; moreover, a cDNA library from human pancreas was screened by using Bacteriomatch®II-System. However, no real interacting partners for TRPV6 could be identified in either screen.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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