SciDok

Eingang zum Volltext in SciDok

Lizenz

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-11277
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2007/1127/


Entwicklung von Realtime-PCR-Methoden zur Analyse von DNA-Methylierung

Development of real time PCR methods for DNA methylation analysis

Tetzner, Reimo

pdf-Format:
Dokument 1.pdf (3.295 KB)

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us
SWD-Schlagwörter: Polymerase-Kettenreaktion , Real time quantitative PCR , DNS , Methylierung , Tumorklassifikation
Freie Schlagwörter (Deutsch): DNA-Methylierung , Realtime-PCR-Methoden
Freie Schlagwörter (Englisch): DNA methylation , real time PCR , methylation specific PCR , HM assay , HeavyMethyl assay , QM assay , quantitative methylation assay
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Walter, Jörn (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.03.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 10.05.2007
Kurzfassung auf Deutsch: DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei einer Reihe biologischer Prozesse wie Imprinting, X-chromosomaler Inaktivierung und Genexpression. DNA-Hypermethylierung ist häufig assoziiert mit einer verminderten Transkription, während Hypomethylierung oft mit einer Aktivierung der Transkription einhergehen kann. Veränderte DNA-Methylierungsmuster sind sowohl bei der Tumorgenese als auch bei einigen genetischen Krankheiten beschrieben. Die Analyse der DNA-Methylierung eignet sich daher zur Klassifizierung von Krebs und anderen Krankheiten. Die schnelle und einfache Detektion von Tumor-DNA in Körperflüssigkeiten anhand ihrer veränderten DNA-Methylierung ist ein innovatives und vielversprechendes Verfahren zur Früherkennung von Krebs. Für diagnostische Zwecke ist die Realtime-PCR besonders geeignet, da sie sich durch Genauigkeit, Schnelligkeit und Automatisierbarkeit auszeichnet. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand daher die Entwicklung von drei Messverfahren zur Methylierungsanalyse im Realtime-PCR-Format sowie die Etablierung einer Methode zur PCR-Kontaminationsvermeidung.
HeavyMethyl-Assay (HM-Assay): Die Anreicherung methylierter DNA in einer PCR kann mit Hilfe von Blockeroligonukleotiden erreicht werden (HeavyMethyl-Assay). Ziel dieser Arbeit war es, dieses Assayformat in ein Realtime-PCR-Format zu übertragen und ein generelles Konzept zur Etablierung von HM-Assays zu erarbeiten. Die Leistungsfähigkeit des Detektionsverfahrens wurde am Beispiel der Entwicklung und Validierung des GSTp1-HM-Assays demonstriert. Das Detektionslimit dieser PCR lag bei 15ipg methylierter DNA. Das entspricht etwa 4i-i5 methylierten Genkopien. Dieser Nachweis gelang auch in einem hohen Hintergrund nicht methylierter DNA, dabei lag das relative Detektionslimit bei mindestens 1:4000. Mit dem GSTp1-HM-Assay wurden anschließend Gewebeproben aus Prostatatumoren analysiert. Die klinische Sensitivität betrug hier 79i% bei einer Spezifität von 95i%. Die Kombination des GSTp1-HM-Assays mit einer GSTp1-Referenz-PCR in einer Duplex-Reaktion erlaubte die gleichzeitige Analyse von methylierter und Gesamt-DNA und erhöhte die Effizienz der Methode. Die Realtime-HM-Technologie ist inzwischen als Standardmethode zur Detektion von Tumor-DNA in Körperflüssigkeiten etabliert und wird bereits in mehr als 20 weiteren Realtime-PCRs zur Detektion von methylierter DNA erfolgreich angewendet.
QuantitativeMethylation-Assay (QM-Assay): Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Weiterentwicklung des QM-Assays, einem Realtime-PCR-Verfahren, das die genaue Bestimmung des Anteils methylierter DNA in Gewebeproben ermöglicht. Durch die neuartige Kombination von SNP-spezifischen und methylierungsspezifischen Sonden konnte erstmals eine allelspezifische, quantitative Analyse von DNA-Methylierung mit einem Realtime-Verfahren realisiert werden. Mit allelspezifischen QM-Assays wurden primordiale Keimzellen aus Mausembryonen untersucht. Für die H19-Region wurde zwischen den Tagen 9,5 und 10,5 nach der Befruchtung eine signifikante Abnahme der parentalen Methylierung gemessen. In der IGF2/DMR2-Region wurde am Tag 9,5 keine Methylierung detektiert, während am Tag 10,5 sowohl maternales als auch paternales Allel geringe Methylierung aufwiesen.
HeavyQuantitativeMethylation-Assay (HQM-Assay): Aus der Kombination von HM-Assay und QM-Assay wurde ein neuartiges Verfahren der Methylierungsanalyse, der HQM-Assay, entwickelt. Dieses Realtime-PCR-Verfahren vereint die Vorteile beider Technologien, die hohe relative Sensitivität des HM-Assays mit den guten quantitativen Eigenschaften des QM-Assays. Es handelt sich dabei um eine Duplexreaktion aus zwei HM-Assays, deren Signale nach dem Prinzip eines QM-Assays ausgewertet werden. Dabei werden methylierte und nicht methylierte DNA des gleichen Locus parallel amplifiziert und analysiert. Mit dem TMEFF2-HQM-Assay konnten DNA-Mischungen mit einem Anteil von 0,1 % und 0,5 % methylierter DNA exakt quantifiziert und damit im Vergleich zu einem QM-Assay eine 10 mal niedrigere Grenze für die quantitative Detektion methylierter DNA erreicht werden.
Verfahren zur Vermeidung von PCR-Kontaminationen: Für die Methylierungsanalyse, basierend auf Bisulfit-DNA, standen bisher keine Verfahren zur Vermeidung von PCR Kontaminationen zur Verfügung. In der Arbeit wurde ein Protokoll für die Bisulfit-Konversion entwickelt, das auf der Herstellung sulfonierter DNA (SafeBis-DNA) basiert. Dieses Protokoll ermöglicht die Anwendung von Uracil-DNA-Glycosylase zum Abbau kontaminierender PCR-Produkte. Die Analyse von Tumorproben ergab die gleichen Ergebnisse unter Verwendung von SafeBis-DNA mit UNG im Vergleich zur Analyse von Standard-Bisulfit-DNA ohne UNG. In dieser Arbeit wurde also erstmalig eine Methylierungsanalyse mit einer effizienten Kontaminationskontrolle durchgeführt. Damit wurde eine weitere Voraussetzung geschaffen, Methylierungsanalysen als diagnostische Tests in der klinischen Routine einzusetzen.
Kurzfassung auf Englisch: DNA-Methylation plays a role in a number of biological processes, such as imprinting, X chromosomal inactivation and gene expression. DNA hypermethylation is closely associated with transcriptional silencing, while DNA hypomethylation is associated with transcriptional activation. The tumor genesis is associated with changes in DNA methylation patterns of the genome, and also characteristic of some genetic diseases. DNA methylation is therefore a suitable tool for the diagnosis and classification of cancer and other diseases. Fast and simple detection and quantification of methylated tumor DNA in body fluids and tissue is an innovative and promising method for the early recognition of cancer. The focus of this work was the development of novel detection procedures for DNA methylation based on the real-time PCR format.
HeavyMethyl Assay (HM-Assay): The enrichment of methylated DNA can be realized by blocked oligonucleotides in a PCR, the so-called HeavyMethyl Assay (HM-Assay). A goal of this work was to develop a robust, high sensitive method for the detection of DNA methylation based on the HM-technology. The HM-Assay was transferred into a real-time PCR format and a concept for the establishment of HM-Assays was compiled. The efficiency of the detection procedure was demonstrated by the development and validation of the GSTp1-HM-Assays. The 90 %-detection limit of this PCR was 15 pg, the relative detection limit was determined with at least 1:4000. That corresponds to 4 - 5 molecules of methylated DNA. Afterwards, samples from prostate tumors were analyzed with the GSTp1-HM-Assay. The clinical sensitivity amounted to 79 %, with a specificity of 95 %. The combination of the GSTp1-HM-Assays with a GSTp1-Referenz-PCR in a duplex reaction allows the parallel analysis of methylated and total DNA. Only very small DNA quantities can be isolated from blood plasma or serum, and thus only a limited number of methylation markers can be analyzed. The multiplexing of GSTp1 and PTGER4-HM-Assay demonstrates one solution to this problem. The duplex real-time PCR was successfully validated on the basis of serum samples. Since then, real time HeavyMethyl technology has been established as the standard method for the detection of tumor DNA in body fluids. It is used in more than 20 additional real time PCR';s for the detection of methylated DNA.
QuantitativeMethylation Assay (QM-Assay): A second goal of the work was the advancement of the QuantitativeMethlylation Assay, a real-time PCR procedure, which allows for the exact determination of the proportional portion of methylated DNA from tissue samples. This is the first time an allele-specific quantitative analysis could be established by the combination of SNP specific and methylation specific probes in a real-time PCR. Calculating the real-time PCR results by fluorescence intensities, simplified the calibration of QM-Assays. The quantitative measurement was also expanded by a preamplification allowing for the analysis of small sample quantities. Allele-specific QM-Assays were then used to investigate the allelic methylation of primordial germ cells from mouse embryos. For the H19-region, a significant decrease in the parentale methylation was measured between days 9.5 and 10.5 after fertilization. No methylation was found on IGF2/DMR2 on day 9.5, while low levels were detected on day 10.5 for the maternale and paternale alleles.
HeavyQuantitativeMethylation Assay (HQM Assay): In the third part of the work the technological combination of HM-Assay and QM-Assay, which is called HQM Assay, was developed. This new real-time PCR procedure combines the advantages of both technologies: the high, relative sensitivity of the HM-Assays, with the good quantitative characteristics of the QM-Assays. The principle is based on a duplex reaction of two HM-Assays, whose signals are evaluated similarly to QM-Assays. In doing so, methylated and non-methylated DNA from the same region can be amplified and analyzed in parallel.
DNA mixtures consisting of 0.1% and 0.5% methylated DNA could be precisely quantified with the TMEFF2-HQM Assay, allowing for the detection of methylated DNA with a limit 10 times lower than that of a QM-Assay.
Procedure for PCR contamination prevention: Avoiding reaction contamination from former PCR products is essential for diagnostic tests. For the methylation analysis, no such procedures are currently available. For this study, a modified protocol for bisulfite conversion was developed, which is based on the generation of sulfonated DNA (SafeBis DNA). It allows for the application of uracil DNA glycosylase to inactivate contaminating PCR products. The method was used successfully in a methylation analysis of tumor samples. The use of SafeBis DNA had no negative influence on the sensitivity and quality of the analysis. This is the first time an efficient carry over prevention system was applied to a bisulfite DNA based methylation analysis.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

Home | Impressum | Über SciDok | Policy | Kontakt | Datenschutzerklärung | English