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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-22006
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2009/2200/


Entwicklung eines Personen-spezifischen Zellkultursystems zur Untersuchung von Hepatitis C Virus Infektionen

Development of a person-specific cell culture system for the analysis of hepatitis C virus infections

Hohn, Christina R.

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SWD-Schlagwörter: Leberepithelzelle , Stammzelle , Hepatitis C , Hepatitis-C-Virus , Zellkultur , Virusinfektion
Freie Schlagwörter (Englisch): liver cells , stem cells , hepatitis C , viral infection , cell culture
Institut: Fachrichtung 2.24 - Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyerhans, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 24.06.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Etwa 200 Millionen HCV-Infektionen weltweit machen Hepatitis C zu einem globalen Gesundheitsproblem (WHO, 2008). In vivo sind Hepatozyten die primären Zielzellen der HCV-Infektion, doch ihre Verwendbarkeit für in vitro Studien ist stark limitiert. Humane Leberkarzinom-Zelllinien wie Huh7 bieten daher bislang die einzige Möglichkeit den HCV-Lebenszyklus zu untersuchen. Aufgrund ihres degenerierten Genoms sowie ihres abweichenden Stoffwechsels spiegeln Huh7-Zellen aber keineswegs die in vivo Situation einer Leberzelle wider. Basierend auf der Notwendigkeit eines alternativen hepatischen Zellsystems wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, ob Monozyten-basierte Neohepatozyten als alternatives Zellsystem für HCV-Studien eingesetzt werden können.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expressionsprofile von Neohepatozyten und Huh7-Zellen große Ähnlichkeiten im Hinblick auf Hepatozyten-spezifische Faktoren aufweisen. Neben Albumin und den bis dato bekannten HCV-Rezeptoren konnte zudem die Leberzell-spezifische miRNA122 nachgewiesen werden. Die Generation der Neohepatozyten gelang dabei sowohl aus PBMC gesunder Spender, als auch aus den Blutzellen von HCV-Patienten.
Infektionsexperimente mit hepatotrophen HCVpp konnten belegen, dass der Großteil der Neohepatozyten für die virale Infektion zugänglich ist. Humanes AB-Serum war dabei ebenso wie das Polysaccharid DEAE-Dextran in der Lage, die HCVpp-Infektionsfrequenz positiv zu beeinflussen. Die Neutralisation der HCVpp-Infektion durch antiCD81-, antiSR-BI- und antiCLDN1-Antikörper zeigte zudem, dass die HCVpp-Infektion in Neohepatozyten über die gleichen Rezeptoren vermittelt wird wie in Hepatozyten. Neutralisierende antiE1E2-Antikörper aus HCV-Patienten hatten dagegen in Neohepatozyten und Huh7-Zellen gegensätzliche Effekte. Während die Infektions-Frequenz in Huh7-Zellen in Anwesenheit der Antikörper gesenkt wurde, hatten die Patienten-Antikörper in Neohepatozyten einen infektionssteigernden Effekt. Dies könnte auf unterschiedliche Wechselwirkungen der Virus-Antikörper-Komplexe mit zellulären Fc-Rezeptoren oder andere Personen-spezifische Faktoren hindeuten. Aufgrund ihrer Eigenschaften als primäre Zellen kam dieser Effekt in Neohepatozyten wahrscheinlich deutlich stärker zum Tragen als in Huh7-Zellen. Der Unterschied zwischen Neohepatozyten und Huh7-Zellen wurde auch im Kontext der HCVcc-Infektion deutlich. Während die getesteten Huh7.5-Zellen aufgrund ihrer Mutation im RIG-Gen den HCVcc-Eintritt sowie die Replikation der viralen Partikel erlaubten, konnte in den Neohepatozyten keine effektive HCVcc-Infektion detektiert werden. Da primäre humane Hepatozyten vergleichbare Ergebnisse zeigten, scheinen Neohepatozyten den in vivo Zustand einer Leberzelle wohl besser zu reflektieren als Huh7-Zellen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Neohepatozyten ein effizientes System darstellen, um den HCV-Zelleintritt Patienten-spezifisch zu untersuchen. Replikations-Studien sind ersten Erkenntnissen zufolge nicht möglich. Die Weiterentwicklung dieses Systems, z.B. im Kleintiermodell könnte allerdings dazu beitragen, Wirts-Faktoren zu identifizieren, die einen Einfluss auf die HCV-Persistenz und -Pathogenese haben. Bezogen auf eine therapeutische Anwendbarkeit könnte die fehlende Replikationseffizienz zudem Vorteile haben: Leberzell-Transplantate wären aus autologen Körperzellen generierbar und eine erneute HCV-Infektion könnte ausgeschlossen werden. Inwieweit diese Ansätze allerdings praktisch umsetzbar sind, müssen künftige Experimente zeigen.
Kurzfassung auf Englisch: HCV is a major cause of chronic liver disease. There is a growing interest in ex vivo generated hepatocytes for several therapeutic issues as well as for infection analysis under relevant ex vivo conditions. Primary human hepatocytes (PHH) represent the primary target cells of HCV, supporting viral replication in vivo, but their availability is limited and establishing and maintaining cultures of PHH has proven difficult. So by now, HCV studies are limited to human hepatoma cell lines like Huh7 that lack a substantial set of liver-specific functions and exhibit a degenerated karyotype with numerous abnormalities. A full understanding of the pathogenesis of HCV requires a tissue culture model that allows studies in a physiological context. According to previous studies we generated a hepatocyte-like cell system (termed Neohepatocytes) from peripheral blood monocytes by culture conditions that promote hepatocyte differentiation (Ruhnke et al., 2005). Based on this system it was investigated, whether Neohepatocytes can be used as a person-specific cell system for HCV infection studies.
A first line of investigation showed that Neohepatocytes express hepatocyte-specific markers like albumin as well as the essential HCV receptors CD81, SR-BI and CLDN-1 in comparable levels to Huh7 cells. Additionally the liver-specific miRNA122 is detectable within these cells, although in lower concentrations than within Huh7 cells. Furthermore, the majority of Neohepatocytes is infectable with hepatotrophic HCV pseudotypes and antibodies against the known HCV host cell entry factors CD81, SR-BI and CLDN-1 are able to neutralize HCVpp infection. The frequency of HCVpp infection could be enhanced by human sera and DEAE-Dextran. Interestingly, neutralizing antibodies derived from chronically infected HCV patients appeared to show a different pattern of neutralization in Neohepatocytes compared to Huh7 cells. While anti-HCV antibodies neutralized HCVpp infection in the Huh7 cell system, nearly all patient-derived IgGs increased the infection rate of HCVpp in Neohepatocytes. These observations could be related to specific interactions of virus-antibody complexes with cellular Fc receptors or with other person-specific surface factors lost in Huh7 cells. HCVcc infection experiments unraveled additional differences between Neohepatocytes and Huh7 cells. While HCVcc infection and viral replication took place in the RIG-deficient Huh7.5 cells, no effective HCVcc infection could be detected in Neohepatocytes. PHH also fail to allow an efficient HCVcc infection, indicating a higher similarity to Neohepatocytes than to Huh7 cells.
Taken together, the here established infection system may represent a valuable cell system to analyze patient-specific virus-host interactions during HCV infection. So far replication studies have been found impossible. But further development of the neohepatic cell system e.g. in a small animal model could help to identify host genetic markers that modify HCV persistence and pathogenesis. For clinical application the missing replication capacity could be even advantageous: transplantation of autologous cells would prevent negative immune responses and reinfection by HCV could be circumvented. However, the practicability of this theory remains to be determined by future investigations.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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