Entwicklung einer Methode zur genomweiten Analyse von DNA-Methylierung und Identifizierung von DNA-Methylierungsbiomarkern in Brustkrebs

Abstract

Ziel der Arbeit war die Identifizierung von DNA-Methylierungsbiomarker für das Ansprechen von Brusttumoren auf eine Chemotherapie. Hierzu wurde die Differentielle Methylierungs Hybridisierung (DMH) optimiert. Durch veränderte Enzymkombinationen wurde der Anteil analysierbarer CpGs erhöht und die Komplexität reduziert. Veränderungen des Protokolls führten zur Senkung der benötigten DNA Ausgangsmenge. Ein wesentlicher Schritt war die Einführung eines für die entstehenden Fragmente spezifischen Mikroarrays und von Kontrollen für die Normalisierung von Komplexitätsunterschieden. Die Reproduzierbarkeit des gesamten Prozesses zeigte einen Korrelationskoeffizienten von 94%. 111 Fragmente wurden direkt bisulfitsequenziert. Der Vergleich beider Methoden zeigte eine hohe Korrelation von 71%. Daher erlaubt die verbesserte Methode eine quantitative genomweite Methylierungsanalyse. Für die Suche nach DNA-Methylierungsbiomarkern wurden jeweils 14 Brusttumore verwendet, deren Metastasen auf eine Chemotherapie ansprachen bzw. nicht-ansprachen. Der Vergleich mit gesundem Gewebe ergab 145 Kandidaten für Aufmethylierung und 202 für Demethylierung in den Tumoren. Beim Vergleich von Ansprechenden und Nicht- Ansprechenden wurden 140 Kandidaten identifiziert. Für die Weiterentwicklung dieser Kandidaten wäre zunächst die Bestätigung der Unterschiede mit einer unabhängigen Methode und in unabhängigen Proben notwendig. Ein erster Schritt war die direkte Bisulfitsequenzierung von 12 Kandidaten. Ein Fragment wies ein p-value von 0,03 beim Vergleich der insgesamt sequenzierten 29 Ansprechenden mit 21 Nicht-Ansprechenden Proben auf, d.h. es zeigte einen statistisch signifikanten Unterschied.

Focus of the study was to identify candidates for markers that predict the response of breast cancer patients to chemotherapy. Therefore the method differential methylation hybridsation (DMH) was chosen to be optimized. The Introduction of a different combination of restriction endonucleases resulted in an increased amount of analyzed CpGs and the reduction of the complexity. A reduction of the DNA input was achieved by modifications of the protocol. A important step was the establishment of an oligonucleotide microarray specifically designed for DMH fragments and of control fragments for the normalization of differences of the complexity. The reproducibility of the complete procedure was high (94 %). The analysis of 111 fragments via direct bisulphite sequencing resulted in a good correlation of 71% with the DMH data. This means the optimized method makes quantitative analysis possible. In order to identify methylation biomarkers in breast cancer 14 chemotherapy responders and 14 non-responders were analysed.The comparison of the tumor and the healthy samples identified 145 tumor marker candidates as hyper-methylated and 202 as downmethylated. Looking at the differences between responders and non-responders 140 candidates were found. The next stepps would be the analysis of the methylation with an independent method and the verification of the differences with independent samples. A first step towards this was the analysis of 12 tumor marker candidates by bisulphite sequencing. One fragment showed a significant difference with a p-value of 0.03 when looking at all sequenced samples, which mean 29 responders and 21 non-responders. Therefore, this fragment is a very promising marker candidate.