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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-31494
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2010/3149/


Site-directed mutagenesis of the steroid-15beta-hydroxylase (CYP106A2) from Bacillus megaterium ATCC 13368 to alter the regio-selectivity of progesterone hydroxylation

Ortsgerichtete Mutagenese der Steroid-15beta-Hydroxylase (CYP106A2) aus Bacillus megaterium ATCC 13368 zur Änderung der Regioselektivität der Progesteronhydroxylierung

Nguyen, Kim Thoa

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SWD-Schlagwörter: Ortspezifische Mutagenese , Cytochrom P-450 , Bacillus megaterium , Progesteron , Hydroxylierung
Freie Schlagwörter (Deutsch): CYP106A2 , 15ß-hydroxylase
Freie Schlagwörter (Englisch): Site-directed mutagenesis , CYP106A2 , 15ß-hydroxylase
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bernhardt, Rita (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 08.06.2010
Kurzfassung auf Englisch: CYP106A2 is known as 15b-hydroxylase, but also shows 11a-hydroxylase activity for progesterone, an important pharmaceutical compound. This work focused on the production of a regio-selective hydroxy derivative of progesterone at the C-11 position using site directed mutagenesis of CYP106A2. Based on the docked progesterone-CYP106A2 model, a saturation mutagenesis library (13100 transformants) at positions A395 and G397 had been created to verify the effect of these residues on the regio-selective hydroxylation. Forty of these transformants were randomly selected and screened for higher 11a-hydroxyprogesterone production. Mutants A395I and A395W/G397K showed the highest 11a-hydroxyprogesterone production (19.5 and 56.4-fold, respectively) despite a lower catalytic activity as compared with the WT. Therefore, these mutants were further mutated to improve their catalytic efficiency. Eight new mutants were found to have a higher turnover rate along with an improved 11a-hydroxyprogesterone production. Mutants A106T/A395I and T89N/A395I showed the highest amounts of 11a-hydroxyprogesterone, 2.8- and 4.4-fold increased, respectively, compared with the parent mutants, and 54.9- and 85.2-fold, respectively, compared with the WT. Interestingly, the in vivo conversion of progesterone with the mutant T89N/A395I nearly produced the 11a-hydroxyprogesterone. Since the 11a-hydroxyprogesterone exhibits an antiandrogeneic activity and plays a role in the regulation of the blood pressure, the mutant has a potential scope as biocatalyst.
Kurzfassung auf Deutsch: CYP106A2 ist als 15b-Hydroxylase bekannt, zeigt aber auch 11a-Hydroxylase Aktivität für Progesteron. Ziel dieser Arbeit war die Produktion regio-selektiver Hydroxyderivaten des Progesterones an Position C-11 mittels zielgerichteter Mutagenese am CYP106A2. Eine 13100 Transformanten umfassende Mutantenbank, hergestellt mittels Sättigungsmutagenese, ausgehend von einem mit Progesteron gedockten Modell, diente als Grundlage. Zur Untersuchung des Einflusses der Aminosäuren auf die Regio-selektivität wurden 40 Transformanten zufällig ausgewählt und auf eine höhere 11a-Hydroxyhydroxylierung gescreent. Die Mutanten A395I und A395W/G397K zeigten, verglichen mit dem WT, die höchste 11a-Hydroxyprogesterone Produktion (19,5- bzw. 56,4-fach), trotz geringerer katalytischer Aktivität. Diese Mutanten wurden nochmals mutiert, um die katalytische Effizienz zu erhöhen. Acht neue Mutanten mit einer höheren Umsatzrate und verbesserter 11a-Hydroxyprogesterone Produktion wurden gefunden. Die Mutanten A106T/A395I und T89N/A395I bildeten 2,8- bzw. 4,4-mal mehr 11a-Hydroxyprogesteron als die jeweilige Ausgangsmutante und sogar 54,9- bzw. 85,2-mal mehr als der WT. Interessanterweise hydroxylierte die Mutante T89N/A395I während des in vivo Umsatzes Progesteron fast ausschließlich an der 11a-Position. Da 11a-Hydroxyprogesteron eine antiandrogene Aktivität zeigt und eine Rolle bei der Regulierung des Blutdrucks spielt, ist zu sagen, diese Mutanten einem großer Erfolg und eine gute Vorraussetzung zur biotechnologischen Anwendung ist.
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