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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45303
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2011/4530/


Characterization of CYP264B1 and a terpene cyclase of a terpene biosynthesis gene cluster from the myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56

Charakterisierung von CYP264B1 und einer Terpen Cyclase aus einem Terpen Biosynthesecluster des Myxobakteriums Sorangium cellulosum So ce56

Ly, Thuy Thi Bich

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SWD-Schlagwörter: Cytochrom P-450 , Sorangium cellulosum , Terpene , Sesquiterpene
Freie Schlagwörter (Deutsch): Terpen-Cyclase
Freie Schlagwörter (Englisch): cytochrome P450 , Sorangium cellulosum , terpene cyclase , sesquiterpene
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bernhardt, Rita (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 22.12.2011
Kurzfassung auf Englisch: In the work presented here, CYP264B1 and the terpene cyclase GeoA of Sorangium cellulosum So ce56 have been characterized. CYP264B1 is able to convert norisoprenoids (a-ionone and b-ionone) and diverse sesquiterpene compounds, including nootkatone. Three products, 3-hydroxy-a-ionone, 3-hydroxy-b-ionone and 13-hydroxy-nootkatone were characterized using HPLC and 1H and 13C NMR. CYP264B1 is the first enzyme reported to be capable to hydroxylate regioselectively both norisoprenoids at the position C-3 as well as nootkatone at the position C-13. The kinetics (Km and Vmax) of the product formation were analyzed by HPLC. The results of docking a-/b-ionone and nootkatone into a homology model of CYP264B1 revealed the structural basis of these selective hydroxylations. In addition, an E. coli whole cell system containing CYP264B1 and its redox partners was created for the biotransformation of CYP264B1 substrates. This system was applied successfully for b-ionone conversion. FPP and GGPP were found to be substrates for GeoA. The sesquiterpene and diterpene products of GeoA are similar to valencene (89%) and neocembrene A (80%), respectively. However, these products are most likely new compounds. In order to characterize them by NMR, a whole cell system based on mevalonate pathwayengineered E. coli was created to faciliate the production of sufficient amounts. The terpene production using this system was investigated, showing that it is possible to obtain the amounts required for NMR analysis if laboratory conditions are optimized.
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurden CYP264B1 und die Terpencyclase GeoA aus So ce56 charakterisiert. CYP264B1 ist in der Lage, Norisoprenoide (a-Ionon und b-Ionon) und diverse Sesquiterpene, inklusive Nootkaton, umzusetzen. Drei Produkte (3-Hydroxy-a-Ionon, 3-Hydroxy-b-Ionone und 13-Hydroxy-Nootkaton) wurden mittels HPLC und 1H und 13C NMR charakterisiert. Damit ist CYP264B1 das erste Enzym, das die Fähigkeit besitzt, regioselektiv Norisoprenoide an Position C-3, sowie Nootkaton an Position C- 13 zu hydroxylieren. Die Kinetik der Produktbildung (Vmax und Km) wurde mittels HPLC analysiert. Durch das Docking von a/b-Ionon und Nootkaton in das Homologiemodell von CYP264B1 konnte die strukturelle Grundlage dieser selektiven Hydroxylierungen aufgeklärt werden. Des Weiteren wurde ein E. coli Ganzell- Sumsatzsystem für die Umsetzung von CYP264B1 Substraten etabliert, das neben CYP264B1 auch seine Redox Partner enthält. Dieses System wurde erfolgreich für dieUmsetzung von b-Ionon eingesetzt. FPP und GGPP wurden als Substrate von GeoA identifiziert. Die jeweiligen Sesquiterpen- und Diterpen- Produkte wiesen Ähnlichkeit mit Valencen (89%), bzw. Neocembren (80%) auf. Jedoch handelt es sich bei den gebildeten Produkten höchstwahrscheinlich um neue Verbindungen. Um ausreichende Mengen dieser Verbindungen für eine NMR Analyse zur Verfügung zu stellen, wurde ein Ganzzell- System aufgebaut, das auf E. coli Zellen die heterolog zusätzliche Proteine des Mevalonat Stoffwechselweges exprimieren, basiert. Durch weitere Optimierung dieses Systems sollte es in Zukunft möglich sein, die für eine NMR Analyse erforderlichen Produktmengen produzieren.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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