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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45368
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2011/4536/


Molekulare Evolution von Dehydrogenase-Varianten zur Herstellung enantiomerenreiner Feinchemikalien

Molecular evolution of dehydrogenase-variants for the production of enantiopure fine chemicals

Gauer, Sabrina

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SWD-Schlagwörter: Dehydrogenasen , Proteindesign , Feinchemikalie , Zuckergewinnung
Freie Schlagwörter (Deutsch): Proteinengineering
Freie Schlagwörter (Englisch): dehydrogenase , protein-engineering , fine chemicals , sugar production
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Giffhorn, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 23.12.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Da die LSDH-Aktivität der 1993 isolierten Stenotrophomonas-Spezies im Zuge der Archivierung verloren ging, wurden erneut Bodenbakterien auf LSDH-Aktivität gescreent. Ein neu isolierter Bodenorganismus (K5) zeigte ebenfalls LSDH-Aktivität. Aufgrund zu geringer Aktivität der K5-LSDH wurde ein weiteres Enzym mit LSDH-Aktivität gesucht. Der N-Terminus des Stenotrophomonas-Enzyms wies hohe Übereinstimmung zur Ribitol-2-DH aus B. japonicum USDA110 auf. Das entsprechende Gen wurde in einen Expressionsvektor kloniert und heterolog exprimiert. Das resultierende Protein besteht aus 243 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 26 kDa je Untereinheit. Die spezifischen Aktivitäten des reinen Enzyms für L- und D-Sorbitol sind 0,1 U/mg bzw. 115 U/mg. Die Km-Werte für L- und D-Sorbitol liegen bei 13,6 mM bzw. 12,7 mM. Biochemische Daten identifizieren das Enzym als Trimer. Bei einem Umsatz mit dem Substrat L-Sorbitol entsteht der seltene Zucker D-Sorbose. Das Temperaturoptimum der LSDH liegt bei etwa 55°C. Als stabilisierende Aminosäuren konnten C68 und M228 identifiziert werden.
Die Stabilität der GatDH konnte durch rationales Design und durch das Einführen neuer Disulfid-Brücken am Dimer-Dimer-Interface leicht gesteigert werden. Verbesserte Varianten sind A57E, A58R und Q168M.
Weitere Modellenzyme für das Projekt ERUDESP, die in dieser Arbeit heterolog exprimiert und charakterisiert wurden waren die DMDH aus L. lactis, die LMDH aus P. putida und die Diaphorase aus C. kluyveri.
Kurzfassung auf Englisch: As the Stenotrophomonas-species isolated in 1993 lost LSDH-activity in the course of archiving, a new soil bacterium with LSDH-activity had to be found. The newly isolated organism K5 showed LSDH-activity, but this was very low. The N-Terminus of the 1993 isolated Stenotropomonas-enzyme revealed high homology to a ribitol-2-dehydrogenase from B. japonicum USDA110. The corresponding gene was cloned to an expression vector and heterologously expressed. The resulting protein consists of 243 amino acids and has a molecular weight of 26 kDa per subunit. The specific activities for L- and D-sorbitol are 0,1 U/mg and 115 U/mg, respectively. Km-values for L- and D-sorbitol are 9,2 and 12,7 mM, respectively. Biochemical data identify the enzyme as a trimer. A bioconversion with the substrate L-sorbitol yielded D-sorbose. The temperature-optimum of LSDH is at 55°C. Amino acids responsible for high temperature stability are C68 and M228.
The stability of GatDH could be increased through rational design and the construction of new disulfide bonds at the dimer-dimer-interface. Improved variants are A57E, A58R and Q168M.
Further model-enzymes for the project ERUDESP, that were heterologously expressed during this work and charakterised were DMDH from L. lactis, LMDH from P. putida and Diaphorase from C. kluyveri.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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