Analyse der Aufrechterhaltung und Reprogrammierung der DNA Methylierung in Säugern mittels Hairpinbisulfitsequenzierung

Abstract

Die Aufrechterhaltung der DNA Methylierung ist für die Genfunktion, die Identität einer Zelle und die Integrität des Genoms von fundamentaler Bedeutung. Weiterhin stellt die Reprogrammierung der DNA Methylierung ein charakteristisches, essentielles Merkmal in spezifischen Phasen der Säugetierentwicklung dar. Um die Stabilität und die Veränderungen des DNA Methylierungsmusters zu untersuchen, wurde die Hairpinbisulfitanalyse gekoppelt mit 454 Sequenzierung für repräsentative Regionen im Mausgenom etabliert. So konnte gezeigt werden, dass die Weitergabe der CpG Methylierung über die Replikation nicht nur auf dem semikonservativen Kopiermechanismus durch Dnmt1 beruht. In detaillierten Analysen an ESCs ließ sich eine komplexe, kontextspezifische Regulation mit unterschiedlichem Beitrag der Dnmts nachweisen. In den Phasen der Reprogrammierung konnte für die analysierten repetitiven Elemente ein stark verändertes Methylierungsmuster mit einem ausgeprägten Anteil an hemimethylierten CpG Positionen gefunden werden. Zudem konnte in der Zygote gezeigt werden, dass diese Veränderungen replikationsabhängig sind und die Elemente nur paternal effektiv demethyliert werden. In ESCs konnte auch eine positionskonservierte Methylierung im Nicht-CpG Kontext gefunden werden, die von Dnmt3a/3b im Zusammenspiel mit Dnmt3L katalysiert wird - wahrscheinlich als Beiprodukt der de novo Methylierung von CpGs. Diese Ergebnisse verdeutlichen eine unerwartet komplexe und dynamische Aufrecht-erhaltung und Reprogrammierung der DNA Methylierung in der Säugetierentwicklung.

Maintenance of DNA methylation is essential for gene function, cellular identity and integrity of the mammalian genome. Furthermore, DNA methylation reprogramming is a characteristic and essential process during specific phases in mammalian development. To analyze the stability and changes of DNA methylation pattern in mammals, hairpin-bisulfite analysis coupled with 454 sequencing was established for representative regions in the mouse genome. Data show that the maintenance of DNA methylation during replication is not only based on a semiconservative copy mechanism by Dnmt1. Detailed analyses on ESCs reveal a complex context-specific regulation with different contribution of the Dnmts. In addition, it was shown that during phases of DNA methylation reprogramming in mammalian development the DNA methylation pattern of the analyzed repetitive elements changes. Changes are characterized by an increasing amount of hemimethylated CpG positions. In the zygote, changes were also shown to be replication dependent and effective DNA demethylation was only observed in paternal elements. Apart from CpG methylation, in ESCs, a position conserved non-CpG methylation was also found, which is catalyzed by Dnmt3a/3b together with Dnmt3L – probably as a byproduct while de novo methylating CpG positions. These results reveal unexpected complex and dynamic maintenance and reprogramming of DNA methylation in mammalian development.