Intracellular Ca2+ content and phosphatidylserine exposure in human red blood cells

Abstract

Ca2+ uptake as well as PS exposure in RBCs has been activated with different substances: lysophosphatidic acid (LPA), phorbol-12 myristate-13 acetate (PMA, activator of the PKC), and A23187 (Ca2+ ionophore, used as positive control). Measurement techniques included flow cytometry and live cell imaging (fluorescence or confocal microscopy). PS exposure is not solely based on the increased intracellular Ca2+ content. Ca2+ activates the scramblase. In addition, we were able to show that the PKC as well as Ca2+-activated K+ channel play substantial role in the process of PS exposure. Ca2+ uptake and PS exposure do not depend on the cell age. Quantitative discrepancies with respect to results obtained by different investigators and also with respect to the LPA batches used have been observed. In addition, we realized differences comparing the results of single and double labelling experiments (for Ca2+ and PS). The results are also affected by the fluorescent dye used. The reason for existing RBCs showing PS exposure but without increased Ca2+ content is do to cell membrane damage and loss of Ca2+ and/or Ca2+ with fluorescent dye shortly before eryptosis. RBCs with increased Ca2+ content but without PS exposure is probably depending on the cell shape (echinocytes show significantly less PS exposure than discocytes or stomatocytes). This result suggests that the shape of the RBCs plays a substantial role for the PS exposure.

Die Ca2+-Aufnahme und die PS-Exposition in humanen roten Blutzellen (RBCs) wurde durch verschiedene Substanzen aktiviert: Lysophosphatidsäure (LPA), Phorbol-12 myristat-13 acetat (PMA, Aktivator der PKC) und A23187 (Ca2+-Ionophor, Positivkontrolle). Die Messmethoden beinhalteten Durchflusszytometrie und Fluoreszenz- bzw. Konfokal-Mikroskopie. Die PS-Exposition basiert nicht nur auf einer erhöhten intrazellulären Ca2+-Konzentration. Ca2+ aktiviert die Scramblase. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass sowohl die PKC als auch der Ca2+-aktivierte K+ Kanal eine substanzielle Rolle im Prozess der PS-Exposition spielen. Die Ca2+-Aufnahme und die PS-Exposition hängen nicht vom Zellalter ab. Quantitative Unterschiede von Messdaten, die von unterschiedlichen Experimentatoren und mit unterschiedlichen LPA-Chargen erzielt wurden, konnten erklärt werden. Zusätzlich konnten Unterschiede der Ergebnisse, die auf der Basis von Einzelfärbungs- und Doppelfärbungs-Experimenten (für Ca2+ und PS) erzielt wurden, aufgeklärt werden. Die Resultate werden auch durch die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe beeinflusst. Der Grund dafür, dass es einige RBCs gibt, die eine PS-Exposition aber keinen erhöhten Ca2+-Gehalt aufweisen, basiert wahrscheinlich auf einer beginnenden Schädigung der Membran unmittelbar vor der Eryptose, was zu einem Verlust an Ca2+ und/oder Ca2+ mit Fluoreszenzfarbstoff führt. Die Existenz von RBCs mit erhöhtem Ca2+-Gehalt, aber ohne PS-Exposition, basiert wahrscheinlich auf der Zellform (Echinozyten haben eine geringere PS-Exposition als Discozyten oder Stomatozyten). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Form der RBCs eine substanzielle Rolle für die PS-Exposition spielt.