SciDok

Eingang zum Volltext in SciDok

Lizenz

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-67948
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2017/6794/


Mining potential drugs and natural products from microbial genomes via improved Red/ET recombineering

Aufspüren von potenziellen Arzneistoffen und Naturstoffen aus mikrobiellen Genomen mittels verbesserter Red/ET Rekombination

Tu, Qiang

pdf-Format:
Dokument 1.pdf (9.486 KB)

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us
SWD-Schlagwörter: Myxobakterien , Heterologe Genexpression , Naturstoff
Freie Schlagwörter (Deutsch): Red/ET Rekombination
Freie Schlagwörter (Englisch): natural products , Red/ET recombineering , heterologous expression , genome mining
Institut: Fachrichtung 8.2 - Pharmazie
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Müller, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.03.2017
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 20.03.2017
Kurzfassung auf Englisch: A great deal of natural product biosynthetic pathways have been detected following the development of bacterial genome-sequencing projects. Reconstruction, genetic modification and heterologous expression of the biosynthetic gene clusters provide an effective approach to discover novel natural product derivatives, while also improving productivities and yields, which sets the stage to expand understanding of their structural diversity and biological activity.
The present thesis copes with several natural product biosynthetic gene clusters of large size (>50kb) and severe complexity with high GC content and repetitive sequences. Typically, it is more challenging to engineer such colossal and complex gene clusters using traditional approaches. Conversely, Red/ET recombineering, without the size and site limitation of DNA engineering established in E. coli, appears to enrich the toolbox of molecular biology and break the size and site limitations of DNA manipulation. Here, we have improved the Red/ET recombination method by changing the long-standing protocol of electrocompetent cell preparation from cold conditions to room temperature, such that the DNA transformation efficiency has been greatly increased. This interesting finding should facilitate the cloning of large fragments from genomic DNA preparations and metagenomic samples.
To exemplify this improvement, the core disorazol biosynthetic pathway (~58kb) from Sorangium cellulosum So ce12 was cloned by improved Red/ET recombineering and heterologously expressed in Myxococcus xanthus DK1622, resulting in an appreciable increase of disorazol production by promoter exchange.
The full-length salinomycin gene cluster (106kb) from Streptomyces albus DSM41398 was isolated from the genome by direct cloning and stitching, and this gene cluster was transferred into the heterologous host S. coelicolor A3 (2).
As a third example of the efficacy of this technique, the magnetosomes gene clusters within a large genomic magnetosome island (~115kb) from magnetotactic bacteria Magnetospirillum gryphiswaldense was cloned and transformed in Rhodospirillum rubrum. A visible red spot near the pole of a permanent magnet could be observed at the edge of a culture flask of heterologous mutants, signifying that the magnetosome products had been successfully expressed in the pink-colored heterologous host.
Kurzfassung auf Deutsch: Ein großer Teil der Naturprodukt Biosynthesewege wurden nach der Entwicklung von bakteriellen Genom-Sequenzierungsprojekten entdeckt. Konstruktion, Modifikation und heterologe Expression der Biosynthesegencluster bieten einen effektiven Ansatz an der Entdeckung von neuen Derivaten der Naturstoffe sowie der Verbesserung der Produktionsausbeute. Dies führt zu der Etablierung einer Plattform zur Erweiterung ihrer strukturellen Vielfalt und der biologischen Aktivität.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit mehreren Naturprodukt-Biosynthesegencluster in großen (>50 kb) und komplexen Genclustern mit hohem GC-Gehalt und repetitiven Sequenzen. Herkömmlicherweise ist es kaum möglich, so kolossale und komplexe Gencluster mit traditionellen Ansätzen zu konstruieren. Folglich erschien Red / ET Recombineering die Toolbox der Molekularbiologie zu bereichern und die Begrenzung der DNA-Manipulation aufzulösen. Wir verbesserten die Red/ET-Rekombination durch Optimierung des langjährig verwendeten Protokolls der Vorbereitung elektrokompetenter Zellen, welches aus dem kalten Zustand auf Raumtemperatur verändert wurde, so dass die DNA-Transformationseffizienz stark erhöht werden konnte. Diese interessante Erkenntnis sollte das Klonieren von großen Fragmente aus genomischer DNA und Metagenomen erleichtern.
Der Disorazol Biosyntheseweg (~58kb) von Sorangium cellulosum So ce12 wurde durch diese verbesserte Red/ET Recombineering Methode kloniert und in Myxococcus xanthus DK1622 exprimiert. Durch Promoter Austausch war die Erhöhung der Disorazol Produktionausbeute möglich.
Das gesamte Salinomycin-Gencluster (106kb) aus Streptomyces albus DSM41398 wurde durch direct-cloning ebenfalls kloniert. Das Gencluster wurde in den heterologen Wirt S. coelicolor A3 (2) übertragen.
Die Magnetosom-Gene innerhalb eines großen genomischen Magnetosom-Insel (115kb) des magnetotaktischen Bakteriums Magnetospirillum gryphiswaldense wurde kloniert und in Rhodospirillum rubrum experimiert. Ein sichtbarer roter Fleck in der Nähe der Pole eines Permanentmagneten konnte am Rande einer Kulturflasche von heterologen Mutanten beobachtet werden.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

Home | Impressum | Über SciDok | Policy | Kontakt | Datenschutzerklärung | English