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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-7013
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2006/701/


Gezielte Inaktivierung von Genen der TRP-Kanalproteine

Targeted disruption of genes of the TRP channel family

Olausson, Jenny

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SWD-Schlagwörter: CRE , Ionenkanal , Knockout <Molekulargenetik>
Freie Schlagwörter (Deutsch): TRPV6 , TRP , transientes Rezeptor Potential , Ionenkanal , Gen-Inaktivierung
Freie Schlagwörter (Englisch): TRPV6 , TRP , transient receptor potential , ion channel , gene targeting
Institut: Fachrichtung 2.4 - Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät: Fakultät 2 - Medizin
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Flockerzi, Veit (Prof. Dr. med)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.06.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 10.11.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung und Inaktivierung des TRPV6 Gens von Maus. Parallel dazu habe ich an den gleichzeitig durchgeführten Experimenten zur Inaktivierung der Gene TRPM4 und TRPM7 mitgearbeitet. Aus dem Vergleich dieser Maus-Tiermodelle mit den entsprechenden Wildtyp-Tieren soll auf die Funktion des ausgeschalteten Gens geschlossen und das TRPV6-Protein als mögliches Zielmolekül für neue Medikamente definiert werden. Zunächst wurde die cDNS von TRPV6 aus polyA+-RNS kloniert, die aus Plazenta von Maus präpariert worden war. Die cDNS umfasst 2184 Basenpaare und kodiert ein Protein von 727 Aminosäureresten. Dieses Protein, das TRPV6-Protein, lässt sich in drei etwa gleich große Bereiche unterteilen. Der Aminoterminus ist hydrophil und im Zytosol lokalisiert; er enthält mehrere Ankyrin-Repeats, Proteinmodule, die für die Dimerisierung von TRPV6-Proteinen essentiell sind. Der mittlere Teil des Proteins ist hydrophob und umfasst sechs Proteinsegmente die wahrscheinlich als alpha-Helizes die Zellmembran durchqueren. Zwischen der fünften und der sechsten Helix liegt eine ca. 30 Aminosäurereste lange Sequenz die zur Pore des TRPV6-Ionenkanals beiträgt. Der C-Terminus ist wiederum hydrophil und im Zytosol lokalisiert. Er enthält mindestens eine Bindungsstelle, die das Protein Calmodulin kalziumabhängig bindet. Nach Expression der TRPV6 cDNS in Zellkulturzellen werden Kationenkanäle exprimiert, die in erster Linie für Ca2+-Ionen permeabel sind und einen Ca2+-Einstrom in die Zelle ermöglichen. TRPV6-Transkripte werden in Zellen der Bauchspeicheldrüse, Niere und Plazenta exprimiert. Allerdings konnte bisher weder von unserer Arbeitsgruppe noch von einer anderen Arbeitsgruppe in diesen Zellen die Ströme durch TRPV6-Kanäle gemessen werden. Die gleichen Protokolle, mit denen nach Expression der cDNS in Kulturzellen kalziumselektive Ströme relativ einfach charakterisiert werden können, führen nicht zur Detektion entsprechender Ströme in Primärzellen aus Pankreas und Plazenta, die TRPV6 'von Natur aus'; exprimieren. Durch Inaktivierung des Gens von TRPV6 in Maus soll diese Diskrepanz aufgelöst werden. Hierzu wurde zunächst das TRPV6-Gen von Maus charakterisiert. Es erstreckt sich über 15 660 Basenpaare, enthält 15 Exonabschnitte und ist auf Chromosom 6 lokalisiert. Im nächsten Schritt wurden verschiedene Strategien zum Targeting des Gens in Erwägung gezogen. Begonnen wurde mit einer Strategie, die es erlaubt, das Gen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems zu inaktivieren, aber gleichzeitig auch über das Tetrazyklin-Regulationssystem zu überexprimieren bzw. seine Expression zu hemmen. Diese Strategie, die sich in parallelen Arbeiten in der Arbeitsgruppe, an denen ich ebenfalls beteiligt war, zum Targeting des TRPM7-Gens auf Anhieb bewährt hat, führte bei TRPV6 zu keinem Ergebnis. Insgesamt 1279 selektionierte ES-Zellklone wurden isoliert, zeigten aber keine Rekombination. Im nächsten Schritt wurde deshalb die verwendete Strategie durch zusätzliche Negativselektion modifiziert. Es wurden 289 selektionierte ES-Zellklone isoliert; allerdings kam es auch bei dieser Strategie zu keiner Rekombination. Es wurde deshalb eine grundlegend andere Targeting-Strategie entwickelt, wobei auch die Zielsequenz des Targetings innerhalb des TRPV6-Gens geändert wurde; statt dem ersten translatierten Exon sollten die Exons 13, 14 und 15 das TRPV6 Gens deletiert werden. Weiterhin wurden jetzt prinzipiell zwei Ziele angestrebt: Erstens sollte das Gen inaktiviert werden, so dass kein Protein translatiert wird. Zweitens sollte das Gen mutiert werden, so dass zwar das Protein synthetisiert wird, es aber nicht die typische Kanalaktivität aufweist. Beide Ziele wurden bei der angewendeten Strategie kombiniert und es konnten aus 1140 selektionierten ES-Zellklonen ein rekombinanter Klon, Klon 6F11, für die Inaktivierung des Gens, und zwei rekombinante Klone, die Klone 8E11 und 16F8, für die Synthese eines inaktiven Proteins isoliert werden. Nach Injektion der ES-Zellen 6F11, 8E11 und 16F8 in Blastozysten und Austragen der resultierenden Embryonen durch Ammenmütter wurden chimäre Tiere für beide Targeting-Ereignisse geboren. Ein Teil dieser Tiere hat die Mutation an die F1-Generation weitergegeben, so dass Tiere enstanden, die heterozygot für die in das TRPV6-Gen eingeführten Mutationen sind. Anschließend wurden diese Tiere untereinander verpaart um so Tiere zu züchten, die homozygot für die eingeführten Mutationen sind. Inzwischen sind vier TRPV6 knock-out Mäuse geboren worden. Aus den Defiziten dieser Tiere im Vergleich zu Wildtyp-Tieren mit unverändertem TRPV6-Gen sollte sich die Funktion des TRPV6-Proteins ergeben sowie neue Perspektiven im Hinblick auf TRPV6 als mögliches Zielmolekül neuer Pharmaka. Parallel zu den Arbeiten zu TRPV6, die den Hauptteil meiner Untersuchungen ausgemacht haben, war ich am Targeting von TRPM7 und insbesondere von TRPM4 beteiligt. Tiere, die homozygot sind für Mutationen in beiden Genen existieren bereits.
Kurzfassung auf Englisch: The major aim of this study was the characterization and inactivation of the mouse TRPV6 gene. First, cDNA of mouse TRPV6 was cloned from polyA+-RNA derived from murine placenta. This cDNA comprises 2184 base pairs, encoding a 727 amino acid protein. TRPV6 is a member of the TRPV subfamily of the TRP superfamily of cation channels, which compromises 28 genes in the mouse genome. Upon heterologous over-expression of TRPV6-cDNA in a mammalian cell line, cation channels are formed which are highly calcium-selective and allow calcium influx into the cell. Within the TRP family, TRPV6, and the highly related TRPV5, are the most calcium selective ion channels. The TRPV6 protein sequence can be subdivided in three segments of approximately the same length. The amino-terminal is hydrophilic and localized in the cytoplasm. It contains several ankyrin-repeats, which are protein modules essential for multimerisation of TRPV6-proteins. The middle part of the protein is hydrophobic and contains six protein segments, presumably spanning the cell membrane as alpha-helices. Between the fifth and the sixth helix a 30 amino acid sequence contributing to the selectivity filter of the TRPV6 ion channel is located. Finally, the carboxy-end is hydrophilic and is again localized in the cytoplasm. It contains at least one binding site for calciumdependent binding of calmodulin. TRPV6 transcripts are found in pancreas, kidney and placenta. Notably, at the time of writing no reports were made concerning the measurement of native TRPV6- channels in these cells, despite the extensive characterization of TRPV6 in a heterologous overexpression system. It is to be expected that the inactivation of the TRPV6 gene in mouse, and subsequent comparison of channel activity in wild-type and KO tissue, is the most promising strategy to overcome this discrepancy. Second, I characterized the mouse TRPV6 gene. It covers 15 660 base pairs, consisting of 15 exons and is localized on mouse chromosome 6. Next, several gene-targeting strategies were considered, and the corresponding targeting vector was constructed. In the initial strategy, the first exon of the TRPV6 gene, containing the start ATG, was targeted. The targeting vector was constructed as such that conditional gene inactivation using the Cre/loxP system, simultaneously with overexpression or inactivation by the tetracycline regulatory system could be achieved. This strategy was successfully applied for targeting of the TRPM7 gene, a project also conducted in our group. However, in case of the TRPV6 gene this strategy did not lead to positive results: a total of 1279 ES-cell clones were isolated but did not show homologous recombination. Therefore, in the next step we modified this targeting strategy by including a negative selection cassette in the targeting vector. 289 ES-cell clones were isolated, but again no clone showed homologous recombination. Thus finally, a totally different targeting strategy was developed using a different part of the TRPV6 gene as target sequence. Instead of the first translated exon, now exons 13, 14 and 15 should be deleted. These exons contain the sequence contributing to the selectivity filter of the TRPV6 channel. Upon removal of these exons a protein consisting of the N-terminus and 5 transmembrane domains will be formed, lacking the ion conducting pore of the TRPV6 channel and the complete C-terminus. Furthermore, in a parallel strategy we aimed at mutating the TRPV6 gene, by introducing a point mutation which would functionally impair channel function, without compromising protein expression. Suitable targeting vectors were constructed and 1140 ES-cell clones were analyzed using southern blot. Among these, one recombinant clone for inactivation of TRPV6 and two recombinant clones for generation of a functionally inactive, but structurally intact protein were identified. Third, these positive clones were injected into blastocysts to generate transgenic animals. After blastocyst injection of the ES-cell clones implantation into surrogate mothers, chimeric mice for both targeting events were born. For each of these groups, some of the mice passed the mutation to the F1-generation, thus establishing germ-line transmission was successful. Heterozygote mice for the introduced mutation were born and are viable. Subsequently, those mice were bread to generate homozygote TRPV6 knock-out mice and at the time of writing four knock-out mice have been obtained. In parallel to the above described work, I simultaneously contributed to experiments leading to the inactivation of the mouse TRPM4 and TRPM7 genes. Mice with homozygote mutations in those genes exist by now, and phenotypes are being analyzed.

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