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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-9139
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2006/913/


Identifizierung von zwei biotechnologisch interessanten Enzymen und ihrer Gene zur stereo- und regioselektiven Modifikation von Kohlenhydraten: Benzoylesterase und Galaktitol-Dehydrogenase

Identification of two biotechnological interesting enzyms and their genes for the stereo and regio selective modification of carbohydrates: benzoyl esterase and galactitol dehydrogenase

Zimmer, Christian

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SWD-Schlagwörter: Enzym , Biotechnologie , Genetik , Angewandte Mikrobiologie , Hefeartige Pilze , Rhodotorula
Freie Schlagwörter (Englisch): enzyme , biotechnology , genetic , Rhodotorula , esterase
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Giffhorn, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.12.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 11.12.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Der in dieser Arbeit aufgrund von 18S- und ITS-Sequenzdaten bestimmte Basidiomyceten-Hefestamm Rhodotorula mucilagiosa saar1 sezerniert unter induzierenden Bedingungen eine Esterase, die in der Lage ist, Ester sowohl mit primären als auch mit sekundären Hydroxygruppen veresterter Benzoesäure zu hydrolysieren. Nach einem Up-scale der Fermentation im Selektionsmedium auf 45 l ließ sich diese hochglykosilierte Benzoylesterase über Ultrafiltration, Ammoniumsulfat-Fällung, Hydrophobe Interaktions-Chromatographie und Anionenaustausch-Chromatographie bis zu einer Reinheit von21 U/mg bei einer Gesamtausbeute von 3,4 mg aufreinigen. Die Ausbeute konnte durch eine Fed-Batch-Strategie, bei der Benzoesäure wachstumslimitierend zugefüttert wurde, auf das Zwölffache erhöht werden. Die hierbei konstant gehaltenen induzierenden Bedingungen ermöglichten eine gezielte Probenentnahme zur Extraktion entsprechender Benzoylesterasen-mRNA. Die Esterase hydrolysiert das Selektionssubstrat Weinsäure-2,3-Di-O-Benzoylester etwa 10-mal schneller als das sich bei dieser Reaktion anreichernde Zwischenprodukt Weinsäure-2-mono-O-Benzoylester. Des Weiteren werden kurze bis mittellange p-Nitrophenylkarbonsäureester sowie weitere Benzoesäureester wie Ethylenglykoldibenzoat, Phenylbenzoat, Kokain und perbenzoylierte 1,5-Anhydrofruktose als Substrate akzeptiert. Das pH-Optimum liegt im neutralen Bereich, das Temperaturoptimum etwa bei 45°C. Da die Aktivität bei 0°C noch 20% der Aktivität bei 30°C entspricht, handelt es sich um ein psychrophiles Enzym. Das Molekulargewicht ließ sich mit Hilfe der Gelfiltration auf ca. 78 kDa bestimmen, während die SDS-PAGE glykosilierungsbedingt 86 kDa ergab. Die Isoelektrische Fokussierung ermöglichte eine Auftrennung in 9 verschiedene Isoenzyme, von denen sich in der 2D-Gelelektrophorese 6 als Bruchstücke der Esterase herausstellten. Das mit 38 kDa kleinere der beiden auftretenden Fragmente ließ sich im Gegensatz zu den übrigen Nterminal mittels Edman-Abbau ansequenzieren. Die gewonnene Sequenz, die Peptid-Fingerprint-Daten und die tandem-massenspektroskopisch gewonnenen Peptidsequenzen führten nicht zur Identifkation einer verwandten Esterase, die eine Sondenableitung innerhalb konservierter Bereiche ermöglicht hätte. Aufgrund ähnlicher Molekülgröße, ähnlicher Substrate und einer ähnlichen Peptid-Sequenz wurde eine Verwandtschaft zur Kokainesterase aus Rhodococcus spec. MB1 angenommen. Eine homologe GxSYxG-Motiv tragende Esterase aus Ensifer meliloti wurde kloniert und funktionell nativ sowie als His(6)-Tag-Fusionsprotein, ebenfalls funktionell, in E. coli exprimiert. Eine Benzoylesterase- bzw. Kokainesterase-Aktivität konnte hier jedoch nicht festgestellt werden. Die Identifikation des Benzoylesterase-Gens erfolgte durch die cDNA generierende RTPCR-Technik, bei der Primer der N-terminalen Bruchstück-Sequenz zur Amplifikation des sezernierten Teils der Benzoylesterase führten. Ein in silico-Abgleich der zuvor generierten Peptid-Fingerprint-Daten bestätigte mit einer Sequenzabdeckung von 60% eindeutig, dass es sich um die gesuchte Benzoylesterase-Sequenz handelt. Das unglykosiliert 60 kDa große Genprodukt ließ sich weder in E. coli noch als sezerniertes Protein in Saccharomyces cerevisiae aktiv exprimieren. Aufgrund der Proteinsequenz konnte diese Esterase den Typ C Feruloylesterasen zugeordnet werden, zu denen auch die Chlorogenatesterase aus Acinetobacter spec. ADP1 entsprechende Homologie besitzt. In dem auf der Kohlenstoffquelle Phenylbenzoat isolierten Stamm Kol4 konnte mit Hilfe abgeleiteter degenerierter Primer aus konservierten Bereichen 80% einer zu 75% homologen Chlorogenatesterase sequenziert werden. Deren beschriebene Variante wurde bereits in E. coli aktiv exprimiert. Aus Rhodobacter sphaeroides D konnte das kodierende Gen der - zu den short chain-Dehydrogenasen gehörenden - Galaktitol-Dehydrogenase identifiziert und funktionell in E. coli exprimiert werden. Das heterolog exprimierte Protein konnte in der Arbeitsgruppe von Prof. Scheidig kristallisiert und seine Struktur aufgeklärt werden. Hieraus ließen sich Rückschlüsse auf den Grund des Aktivitätsverlustes der C-terminal His(6)-getagten Variante ziehen, die zur Verbesserung der Aufreinigungsstrategie erstellt wurde. Dieser totale Aktivitätsverlust ließ sich bei einer C-terminal um drei Aminosäuren verkürzten Variante bestätigen und durch die Konstruktion einer N-terminal His(6)-getagten Variante unter Zugewinn der gewünschten Affinität umgehen. Der Sequenzvergleich des GatDH-Gens des Stammes D mit dem für ihn parentalen Stamm Si4 zeigte keinen Unterschied in der kodierten Aminosäuresequenz, was eine Enzymevolution als Ursache für die Entstehung des Galaktitol verwertenden Stammes D ausschließt. Auf Nukleinsäureebene konnte im Bereich der den N-Terminus kodierenden Sequenz eine partielle Sequenz-Duplikation festgestellt werden, die die Entstehung einer optimalen ribosomalen Bindungsstelle verursachte.
Kurzfassung auf Englisch: A pink-colored yeast producing small amounts of a benzoylesters hydrolyzing esterase was identified as a strain of Rhodotorula mucilaginosa by sequencing the 18S rDNA and the ITS-region. During growth the yeast hydrolyzed the screening substrate (2R,3R)-(-)-di-Obenzoyl-tartrate stoichiometrically to the monoester before the monoester was further cleaved into benzoic acid and tartrate. The strain, called saar1, was able to metabolize both hydrolysis products. The secernated and highly glycosylated esterase was purified from 45 l supernatant by ultra filtration followed by ammonium sulphate precipitation, hydrophobic interaction chromatography and anion exchange chromatography to a purity of 21 U/mg and a yield of 3.4 mg. The monomeric 86-kDa protein was characterized with an optimum pH of 7.5 and an optimum temperature of 45°C. At 0°C the esterase still exhibited 20% of the corresponding activity at 30°C, which approximates it to psychrophilic enzymes. Short chain p-nitrophenyl-alkyl esters and several benzoyl esters like benzoyl-methy ester, ethylene-glycol-dibenzoyl ester, phenyl-benzoyl ester, cocaine and 1,5-anhydro-D-fructose-tribenzoyl ester were also substrates for the esterase. In electrophoreses the esterase separated, namely into 9 isoforms around pH 4.4 in isoelectric focusing and into 3 bands of 86 kDa, 48 kDa and 38 kDa in SDS-PAGE. The 38-kDa band was even suitable for N-terminal sequencing by Edman-degradation. Further peptide data was recorded by MALDI-ToF and nano-HPLC-ESI-MS/MS. Degenerated primers in RT-PCR were used for gene identification of benzoyl-esterase, which was verified by peptide-mass-fingerprint data. The gene shows no homology to any other known esterase, but the protein sequence shows relation to the type C feruloyl esterases. Neither E. coli nor Saccharomyces cerevisiae offer a suitable expression system for the expression of an active form of benzoyl-esterase. An esterase from Ensifer meliloti which is closely related to the cocaine-esterase of Rhodococcus spec. MB1 and which is also containing a GxSYxG-motive was cloned and actively expressed as wild type and His(6)-tagged form in E. coli. Neither of these forms show any activity with (2R,3R)-(-)-di-O-benzoyl-tartrate or cocaine. In Acinetobacter calcoaceticus Kol4 the existence of another type C feruloyl esterase was verified and the corresponding gene was partially sequenced. This fragment only shows 75% homology to the known chlorogenate esterase from Acinetobacter spec. ADP1. It is most likely the phenylbenzoate hydrolyzing esterase which allows growth on this carbon source. The gene of the Rhodobacter sphaeroides D galactitol dehydrogenase was identified and expressed in E. coli in native, N- terminal and C-terminal His(6)-tagged forms. Only the native and the N-terminal tagged forms showed activity. The crystal structure suggests that one magnesium ion is coordinated by two opposite subunits in the homo-tetrameric holoenzyme. A loss of function was also observed with a 3-amino acids-truncated version of the dehydrogenase. The galactitol metabolizing Rhodobacter sphaeroides D was identified as a gain of function mutant of the Rhodobacter sphaeroides Si4. The only detectable genetic difference between the strains was a 21 bp sequence duplication resulting in a new potent ribosomal binding site in Rhodobacter sphaeroides D.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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