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URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-9617
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2007/961/


Cortisolproduktion in Schizosaccharomyces pombe : eine Analyse verschiedener Varianten des CYP11B1 Enzyms

Cortisol production in Schizosaccharomyces pombe : an analysis of different variants of the CYP11B1 enzyme

Zearo, Silvia

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SWD-Schlagwörter: Hydrocortison , Schizosaccharomyces pombe , Cytochrom P-450 , Mutation
Freie Schlagwörter (Englisch): hydrocortisone , fission yeast , cytochrom P450 , mutation
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bernhardt, Rita (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.12.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 13.02.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Cortisol und Aldosteron, gehören zu den Corticosteroiden und werden in der Nebennierenrinde synthetisiert. Beim Menschen werden die finalen Schritte der Cortisol- und Aldosteronsynthese durch CYP11B1 und CYP11B2 katalysiert. CYP11B1 katalysiert die 11β-Hydroxylierung von 11-Desoxycortisol (RSS) zu Cortisol. Aufgrund der mannigfaltigen physiologischen Aufgaben des Cortisols bei der Gluconeogenese, dem Fettabbau, dem Flüssigkeits- und Mineralstoffhaushalt sowie der Immunantwort, ist die Regulation seiner Synthese auf molekularer Ebene von großem wissenschaftlichem Interesse. Darüber hinaus besteht aufgrund des hohen Bedarfs in der Medizin die Notwendigkeit, Cortisol schnell und kostengünstig zu produzieren. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die enzymatische Cortisolproduktion durch die Entwicklung einer oder mehrerer gentechnisch veränderter Varianten des CYP11B1 mit einer erhöhten enzymatischen Aktivität zu optimieren. Darüber hinaus sollten neue Erkenntnisse über die Regulation der Aktivität des CYP11B1 auf molekularer Ebene generiert werden.
Da CYP11B1 und CYP11B2 an die innere Mitochondrienmembran gebunden sind, gestaltet sich sowohl ihre Kristallisierung als auch eine weiterführende in vitro Analytik schwierig. Deshalb wurde mit dem Hefepilz S. pombe ein modernes, gut geeignetes in vivo System für die Umsetzung des geplanten Vorhabens eingesetzt. Außerdem besitzt S. pombe mit dem electron transport protein 1 (etp1) ein Protein, dessen C-Terminus dem natürlichen Redoxpartner des CYP11B1, Adrenodoxin (Adx), in Struktur und Funktionalität sehr ähnlich ist. Um die Auswirkungen mehrerer natürlicher und artifizieller Enzyme auf die Cortisolsynthese zu untersuchen, wurden eine Reihe von verschiedenen CYP11B enthaltenden Plasmiden generiert. Dabei wurden zum einen durch ortsgerichtete Mutagenese in funktionell relevanten Strukturdomänen diverse Mutanten des humanen CYP11B1 im pCAD1 Plasmid generiert. Die Auswahl potentiell interessanter Positionen in der Aminosäuresequenz erfolgte auf der Basis von Erkenntnissen über bereits bekannte Mutationen sowie von Computer-gestützten Modellen des Enzyms. Zum anderen wurden CYP11B cDNAs aus Mensch, Affe, Rind, Ratte und Meerschweinchen amplifiziert und in den pNMT1-TOPO Vektor kloniert. Mit diesen Plasmiden wurden Hefe Zellen transformiert und neue S. pombe Stämme generiert. In den so erzeugten Hefestämmen wurde dann die Proteinexpression mittels Western Blot und die enzymatischen Aktivität durch den Umsatz des Substrates RSS zu Cortisol gemessen.
Mittels Western Blot konnte die erfolgreiche Expression der entsprechenden CYP11B Varianten in allen generierten Stämmen nachgewiesen werden. Die Enzyme der ortsgerichteten Mutagenese wurden in verschiedene Gruppen eingeteilt, die wichtige strukturelle Regionen für den katalytischen Prozess widerspiegeln. Keine der Varianten mit einer Modifikation im aktiven Zentrum zeigte eine Aktivitätssteigerung. Mutationen im Bereich der Interaktionsstelle mit dem Redoxpartner führten zu inhomogenen Veränderungen der katalytischen Aktivität. Einige Mutanten verloren vollständig ihre enzymatische Aktivität, während bei anderen entweder eine Reduktion oder eine leichte Erhöhung der enzymatischen Aktivität nachweisbar war. Die höchste Aktivität von den durch gerichtete Mutagenese erzeugten Varianten konnte bei den Stämmen SZ1 und SZ78 beobachtet werden. Diese Stämme exprimieren die Enzyme CYP11B1M52LV78I und CYP11B1V78I, welche eine 3,5- bzw. 3fache Erhöhung der Aktivität im Vergleich zum Referenz Stamm zeigten. Diese Mutationen befinden sich in der für die Erkennung und Bindung des Substrates zuständigen Region des Proteins. Die Untersuchung der verschiedenen Tierarten ergab eine deutlich gesteigerte Aktivität des Affenenzyms (Stamm PHB1). Die Aktivität war im Vergleich zum humanen Referenzstamm (HSB1) um das 6,2fache erhöht. Bei den Stämmen SZ1A (CYP11B1M52LV78I mit der mitochondrialen Importsequenz des humanen CYP11B2), SZ1B (CYP11B1M52LV78I mit der Importsequenz des humanen CYP11B1) und HSB2M (hsCYP11B2P112IE147D) lies sich ebenfalls eine leicht erhöhte Aktivität nachweisen. Das Ausmaß der Aktivitätssteigerung bewegte sich zwischen dem 1,5—3fachen von HSB1. Auch in diesen Fällen können Unterschiede im Bereich der Region der Erkennung und Bindung des Substrates als Ursache für die Aktivitätszunahme vermutet werden.
In dieser Arbeit wurden umfangreiche neue Informationen über CYP11B1 generiert, die einen tieferen Einblick in die Beziehung zwischen Struktur und Funktion dieses Enzyms ermöglichen. Insbesondere Mutationen im Bereich der Substratbindungsstelle scheinen besonders viel versprechend für die Generierung von CYP11B1 Varianten mit erhöhter Aktivität zu sein. Zukünftige Untersuchungen müssen diese Erkenntnisse bestätigen und in weiterführenden Experimenten vertiefen.
Kurzfassung auf Englisch: The corticosteroids cortisol and aldosterone are synthesized in the adrenal cortex by a complex reaction cascade, catalyzed by several cytochromes P450 (CYP). CYPs belong to the external monooxygenases and are able to introduce molecular oxygen into their substrates. In humans the final steps of the cortisol and aldosterone synthesis are catalyzed by CYP11B1 and CYP11B2. CYP11B1 is responsible for the conversion of 11-desoxycortisol (RSS) into cortisol. CYP11B2 promotes the 11β-hydroxylization of 11-desoxycorticosterone (DOC) into corticosterone followed by an 18β-hydroxylization leading to the formation of 18-hydroxicorticosterone and finally after an oxidation at position 18 into aldosterone. Due to the involvement of cortisol in many physiological processes, e.g. gluconeogenesis, lipid metabolism, liquid and mineral homeostasis, and immunosuppression, the regulation of Cortisol synthesis on molecular level is of particular scientific interest. Moreover, modern medicine requires a growing amount of cortisol every day. Consequently, a cost efficient production of large amounts of cortisol is necessary. The aim of the present study was the development of CYP11B1 mutants with an increased enzymatic activity. In addition, this work should provide new insights in the regulation of CYP11B1 activity on a molecular level.
Since CYP11B1 and CYP11B2 are bound to the inner membrane of the mitochondria, the crystallization and in vitro analysis of these two enzymes is difficult. Consequently the bear S. pombe was chosen as a suitable in vivo system for this investigation. S. pombe contains the electron transport protein 1 (etp1fd) with a C-Terminus, that shares many structural and functional similarities with the genuin redox partner of CYP11B1 adrenodoxin (Adx). To analyze the consequences of many natural and artificial mutations of CYP11B1 on cortisol synthesis several CYP11B containing plasmids were created. On the one side, a group of mutations were generated by modifying different functionally structure domains of human CYP11B1. Interesting residues for site directed mutagenesis were selected on the base of known mutations and computer models of the enzyme and introduced into the pCAD1-vector. On the other, side human, avian, bovine, rat and guinea pig CYP11B cDNA was amplified and cloned into the pNMT1-TOPO vector. With the generated plasmids were transformed bear cells and were created new S. pombe strains. In all transformed S. pombe strains CYP11B protein expression was analyzed by Western blotting. The enzymatic activity was tested by following the conversion of RSS into cortisol. The amount of cortisol was quantified by high performance liquid chromatographie (HPLC).
Western blotting demonstrated CYP11B protein expression in all created strains. Enzymes from the site specific mutagenesis were classified according to the location of mutations in various functionally structure domains. None of the strains with a mutation in the active core exhibited an increased enzymatic activity. Modifications within the redox partner binding domain caused inhomogeneous effects on the catalytic process. Some mutants showed a complete loss of activity. Others had a reduced or slightly increased activity. Among the strains of site directed mutagenesis, the highest enzymatic activity was observed in the strains SZ1 and SZ78 expressing CYP11B1M52LV78I and CYP11B1V78I. CYP11B1M52LV78I exhibited a 3.5-fold and CYP11B1V78I a 3-fold increase of cortisol synthesis compared to the protein in the reference strain. Both mutations are located in the substrate binding domain of the protein. The analysis of CYP11B enzymes from various species revealed a strongly elevated activity of the avian enzyme (strain PHB1). Compared to the human reference strain (HSB1) PHB1 had a 6.2 fold higher activity. The strains SZ1A (CYP11B1M52LV78I with the mitochondrial import sequence of human CYP11B2), SZ1B (CYP11B1M52LV78I with the mitochondrial import sequence of human CYP11B1) and HSB2M (hsCYP11B2P112IE147D) exhibited also an elevated activity. The magnitude of this elevation ranged from 1,5 to 3fold compared to HSB1. Compared to HSB1, these strains exhibit differences in the substrate binding domain, which could be a suitable explanation of the elevated activity.
The present study provides new information about the relation between structure and function of CYP11B1. Mutations in the substrate binding domain seem to be most promising to induce an increased enzymatic activity. Future studies have to confirm these findings.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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