2024-03-28T09:15:54Zhttps://publikationen.sulb.uni-saarland.de/oai/requestoai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/208722019-01-10T08:03:03Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
TRPV6 und TRPM8: Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen
TRPV6 and TRPM8: Analysis of protein-protein-interactions
Erler, Isabell Christine
Flockerzi, Veit
ddc:500
Proteine
Ionenkanal
TRPV6
TRPM8
Multimerisierung
TRP
Coiled Coil
Ankyrin Repeats
Die Proteine der TRP-Familie bilden Kationenkanäle, die an verschiedenen sensorischen und zellbiologischen Prozessen beteiligt sind. Strukturell zeigen sie eine Ähnlichkeit zu den Kaliumkanälen, die eine tetramere Struktur aufweisen. Man nimmt deshalb an, dass sich jeweils vier monomere TRP-Proteine zu einem funktionellen tetrameren Ionenkanal zusammenlagern. Ein tetramerer Aufbau war zu Beginn dieser Arbeit nur für TRPV1 angedeutet worden. Durch welche Interaktionsdomänen eine Multimerisierung vermittelt wird, und ob es phylogenetisch konservierte Signale und Mechanismen dafür gibt, war unbekannt. Da sich aber verschiedene Mitglieder der TRP-Familie hinsichtlich ihrer zytoplasmatischen Proteinmotive stark unterscheiden, liegt die Vermutung nahe, dass ihre Tetramerisierungssignale unterschiedlich sind. In dieser Arbeit wurden Homomultimerisierungsdomänen der beiden Proteine TRPV6 und TRPM8 identifiziert und untersucht und es wurde gezeigt, dass beide Proteine Tetramere bilden können. TRPV6 ist vermutlich an der intestinalen und transplazentalen Resorption von Kalzium beteiligt, TRPM8 spielt wahrscheinlich eine Rolle bei der Kälteperzeption durch das somatosensorische System. Beide Kanäle zeigen außerdem eine verstärkte Expression in malignen Formen des Prostatakarzinoms, und zumindest für TRPV6 scheint die verstärkte Kanalexpression mit einer verstärkten Proliferation zu korrelieren. Das Verständnis der jeweiligen Strukturen und Signale, die den funktionellen Kanal-Zusammenbau vermitteln, würde nicht nur erlauben das Zusammenlagern der TRP-Proteine zu Kanälen zu verstehen, sondern könnte zukünftig auch eine Bedeutung für die Entwicklung neuer Pharmaka haben. Zur Identifizierung und Analyse der Proteindomänen wurden verschiedene Methoden eingesetzt: Die mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System verwandten Systeme Bacteriomatch® und Bacteriomatch®II wurden etabliert, weiterentwickelt und zur Analyse von homo- und heterotypischen Proteininteraktionen angewendet. Außerdem wurden markierte Ionenkanal-Fusionsproteine mit TRPV6 bzw. TRPM8 ko-immunpräzipitiert. Identifizierte Proteindomänen wurden anschließend gezielt mutiert und die mutierten Proteine auf ihre Fähigkeit untersucht, Proteinkomplexe und funktionelle Ionenkanäle zu bilden. Weiter wurden in dieser Arbeit Heteromultimerisierungen von TRPV6 mit anderen Mitgliedern der TRPV-Unterfamilie untersucht. In verschiedenen Experimenten konnte TRPV6 nicht mit TRPV2, TRPV3 und TRPV4 ko-immunpräzipitiert werden. Mit TRPV1 wurde dagegen eine schwache Interaktion beobachtet; TRPV5 wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit war die Suche nach unbekannten Interaktionspartnern von TRPV6. Da zu Beginn dieser Arbeit außer Calmodulin keine mit TRPV6 interagierenden Proteine bekannt waren, sollten neue Proteine, die mit dem TRPV6-Carboxyterminus interagieren, mit einem Bakterien-Zwei-Hybrid-System identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde zuerst eine cDNS-Bibliothek aus humaner Plazenta hergestellt und mit dem Bacteriomatch®-System durchsucht; danach wurde eine cDNS-Bibliothek aus humanem Pankreas von Mensch mit dem Bacteriomatch®II-System durchsucht. Mit beiden Bibliotheken konnten jedoch keine spezifisch interagierenden Proteine gefunden werden.
Proteins of the TRP family form cation channels involved in many different sensory and cellular processes. Regarding their structure, they display some similarities to voltage gated potassium channels, which exhibit a tetrameric structure. It is thus assumed that four monomeric TRP proteins assemble to form a functional tetrameric ion channel. At the beginning of this work, a tetrameric structure was postulated only for TRPV1. It was unknown which interaction domains mediate a multimerisation and whether there are conserved signals and mechanisms for TRP channel assembly. The fact that cytoplasmatic protein motifs differ especially between members of different TRP family subgroups leads to the assumption that their tetramerisation signals are different. In the framework of this thesis, homomultimerisation domains of the two TRP proteins TRPV6 and TRPM8 were identified and it was shown that both proteins can form tetramers. TRPV6 is most likely involved in intestinal and placental absorption of calcium, TRPM8 presumably plays a role in cold perception via the somatosensoric system. Both ion channels are overexpressed in malignant forms of prostata cancer, and at least in case of TRPV6, expression of TRPV6 transcripts seems to correlate with enhanced proliferation. Knowledge of structures and signals responsible for the assembly of functional channels would not only permit the understanding of the formation of TRP ion channels, but could also be of interest for the development of new pharmaceuticals. Several methods were used to identify and analyse interacting protein domains: the two systems Bacteriomatch® and Bacteriomatch®II, which are conceptually similar to yeast two hybrid systems were established, refined and applied to analyse homo- and heterotypical protein interactions. Furthermore, tagged ion channel fusion proteins were co-immunoprecipitated with TRPV6 and TRPM8 respectively. After identification, protein interaction domains were mutated by directed point mutagenesis and tested for their ability to form protein complexes and functional ion channels. Moreover, heteromultimerisations of TRPV6 with other members of the TRPV-subfamily were investigated in the course of this thesis. In repeated experiments, TRPV6 could not be co-precipitated with TRPV2, TRPV3 and TRPV4, whereas there was a weak interaction with TRPV1; TRPV5 was not tested. Another aim of this thesis was the identification of unknown proteins interacting with TRPV6. Since there were no known proteins interacting with TRPV6 other than calmodulin when this thesis was started, a screen for new interaction partners with the carboxyterminal region of TRPV6 was performed using a bacterial two hybrid system. For this purpose, a cDNA library was synthesized from human placenta and screened by using the Bacteriomatch®-System; moreover, a cDNA library from human pancreas was screened by using Bacteriomatch®II-System. However, no real interacting partners for TRPV6 could be identified in either screen.
2007-02-20
2017-07-12T06:56:44Z
2007-02-20
2006
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-10221
hdl:20.500.11880/20872
http://dx.doi.org/10.22028/D291-20816
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/208732019-01-10T08:03:03Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
The 2C-series - a new class of designer drugs
Die 2C-Reihe - eine neue Klasse von Designer-Drogen
Theobald, Denis Stephan
Maurer, Hans H.
ddc:500
GC-MS
Synthetische Droge
Designerdroge
2C-Reihe
2C-series
designer drugs
GC-MS
metabolism
monoamine oxidase
Studies are presented on the metabolism and toxicological detection of the most important compounds of the so-called 2C-series. The isoenzymes involved (MAO, CYP) in the major metabolic step are presented.
Studien werden präsentiert zum Metabolismus und toxikologischen Nachweisverfahren der wichtigsten Vertreter der sogenannten 2C-Reihe. Des Weiteren werden die am Hauptmetabolismusschritt beteiligten Isoenzyme vorgestellt (CYP, MAO).
2007-03-20
2017-07-12T06:56:44Z
2007-03-20
2006
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-9601
hdl:20.500.11880/20873
http://dx.doi.org/10.22028/D291-20817
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/210022019-01-10T08:03:04Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Elektrophysiologische Charakterisierung von TRPM3 Ionenkanälen
Electrophysiological characterization of TRPM3 ion channels
Loch, Sabine Petra
Flockerzi, Veit
ddc:500
Ionenkanal
Nifedipin
TRPM3
Pregnenolonsulfat
fraktioneller Calciumstrom
ion channel
nifedipine
pregnenolon sulfate
TRPM3
fractional calcium current
Ionenkanäle sind Transmembranproteine, die nur für bestimmte Ionen durchlässige Poren in den Membranen der Zellen ausbilden. Sie spielen eine zentrale Rolle bei der Steuerung fundamentaler Lebensprozesse und sind daher in allen Zellen zu finden. Für das Verständnis der physiologischen Funktion eines Ionenkanals, ist die Kenntnis seiner Aktivierungs- und Regulationsmechanismen sowie seiner Selektivitäts- und Permeationseigenschaften von grundlegender Bedeutung. In der vorliegenden Promotionsarbeit wurden diese Eigenschaften von TRPM3, einem der am schlechtesten charakterisierten Mitglieder der TRP-Proteinfamilie, mit Hilfe der Elektrophysiologie untersucht. TRPM3a2 - eine durch alternatives Spleißen gebildete TRPM3-Variante, die einen Ca2+-permeablen Kationenkanal ausbildet - wird durch das Neurosteroid Pregnenolonsulfat und in geringerem Maße auch durch die Pregnenolonsulfat strukturell sehr nahestehenden Neurosteroide Pregnenolon, Dehydroepiandrosteron und Dehydroepiandrosteronsulfat sowie dem L-Typ Ca2+-Kanal-Blocker Nifedipin aktiviert. Im ersten Kapitel wurden die Dosis-Wirkungskurven der verschiedenen Agonisten ermittelt. Weiterhin wurde gezeigt, dass Neurosteroide TRPM3a2 nur von der extrazellulären Seite her aktivieren und dass Nifedipin an eine von den Neurosteroiden abweichende Bindungsstelle bindet. Die Ergebnisse des zweiten Kapitels zeigen, dass TRPM3a2 eine hohe Permeabilität für alle divalenten Kationen aufweist. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Agonist Pregnenolonsulfat die Eigenschaften des Selektivitätsfilters nur geringfügig beeinflusst. Im dritten Kapitel wurden die Interaktionen der permeierenden Kationen mit der ionenleitenden Pore näher untersucht. So konnte gezeigt werden, dass Ca2+ nur eine recht schwach-affine Bindungsstelle in der Pore besitzt. Trotzdem beträgt - unter annähernd physiologischen Bedingungen - der Ca2+-getragene Anteil des Stromes durch TRPM3a2-Kanäle 24%. Dieser Anteil ist für TRPM3a2-Kanäle viel höher als für andere TRP-Kanäle, die durch schnellwirkende Agonisten reguliert werden. Im vierten Kapitel wurde gezeigt, dass die Aktivität von TRPM3a2 durch intrazelluläres Mg2+, extrazelluläre Protonen und extrazelluläre, monovalente Kationen reguliert sowie durch die unspezifischen Kationenkanalblocker Gd3+, La3+ und Rutheniumrot gehemmt wird. Die in den vier Kapiteln ausgearbeiteten biophysikalischen Eigenschaften von TRPM3a2-Kanälen bilden das Fundament für zukünftige Untersuchungen, mit denen es nun möglich ist, endogene TRPM3a2-Kanäle zu identifizieren und ihre physiologische Funktion aufzuklären.
Ion channels are transmembrane proteins that provide pathways for the movement of ions across cellular membranes. Ion channels play a cruical role in the regulation of fundamental life processes and are therefore found in the membranes of every cell. In order to understand the physiological function of an ion channel, knowledge about its activation and regulation mechanisms as well as its selectivity and permeation properties is of fundamental importance.
In the present study, these properties of TRPM3, one of the least characterized members of the TRP ion channel family, were investigated electrophysiologically. TRPM3a2 - a TRPM3 splice variant, which can form Ca2+ permeable cation channels - is activated by pregnenolone sulfate and - to a much lesser extent - by its structurally closely relatives pregnenolone, dehydroepiandrosterone and dehydroepiandrosterone sulfate as well as the L-type Ca2+ channel blocker nifedipine. The first chapter of the present study focuses on the dose-response curves of the different agonists. Moreover, the data presented in this chapter demonstrate that the neurosteroids activate TRPM3a2 exclusively from the extracellular side and that nifedipine binds to TRPM3a2 at another binding site than the neurosteroids. The results of the second chapter show that TRPM3a2 is highly permeable for divalent cations. They also demonstrate that the agonist pregnenolone sulfate has only minor effects on the properties of the selectivity filter. In the third chapter the interactions of TRPM3a2 permeating ions with the ion conducting pore were analysed. The results show that the pore of TRPM3a2 channels contains only a low affinity binding site for Ca2+ ions. Nevertheless, the fraction of current carried by Ca2+ amounts 24% under nearly physiological conditions. This fraction is much higher for TRPM3a2 than for other TRP channels regulated by fast-acting agonists. The fourth chapter demonstrates that the activity of TRPM3a2 is regulated by intracellular magnesium, extracellular protons and extracellular monovalent cations and is inhibited by the unspecific cation channel blocker Gd3+, La3+ and ruthenium red. The biophysiological properties of TRPM3a2 channels determined in this thesis can be used to identify endogenous TRPM3 channels and to determine their physiological functions.
2008-01-22
2017-07-12T06:57:25Z
2008-01-22
2007
2008-01-22
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-14158
hdl:20.500.11880/21002
http://dx.doi.org/10.22028/D291-20946
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/211142019-01-10T08:03:04Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
The 2,5-dimethoxyamphetamines — a new class of designer drugs : studies on the metabolite identification, toxicological analysis, involvement of cytochrome P450 isoforms in main metabolic steps, and inhibition potentials on cytochrome P450 2D6
Die 2,5-Dimethoxyamphetamine — eine neue Klasse von Designerdrogen : Studien zum Metabolismus, Toxikologische Analyse, Beteiligung von Cytochrom P450 Isoformen an den Hauptmetabolismusschritten und Potentiale zur Inhibition von Cytochrom P450 2D6
Ewald, Andreas Heinrich
Maurer, Hans H.
ddc:500
GC-MS
Synthetische Droge
Stoffwechsel
Cytochrom P-450
Inhibition
Designerdroge
Metabolismus
designer drugs
cytochrome P450
In the presented studies, the metabolism and the toxicological analysis in urine of the amphetamine-derived designer drugs DOB, DOC, DOI, DOM, MDOB and TMA-2 were investigated. Furthermore, CYP isoform dependence of the main metabolic steps and the inhibition potential of the parent drugs on CYP2D6 were elucidated to predict possible drug-drug interactions and influence of genetic polymorphisms. The 2,5-dimethoxyamphetamines were mainly metabolized by O-demethylation in position 2 and 5 of the ring, respectively, and by deamination followed by reduction to the corresponding alcohol. A further metabolic step was the hydroxylation of the side chains. Phase II reactions consisted of partial glucuronidation and/or sulfation. Combinations of these steps could also be detected. The target analytes for the toxicological analysis were the derivatized hydroxy metabolite of DOM or the O-demethyl metabolites of DOB, DOC, DOI, MDOB and TMA-2. CYP2D6 was identified to be the only CYP isoform involved in the main metabolic steps. In addition, the studied drugs act also as inhibitor of CYP2D6. It could be shown, that the mode of inhibition of none of the studied drugs was irreversible, but competitive for all drugs.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden der Metabolismus und die Nachweisbarkeit der neuen Designerdrogen des Amphetamin-Typs DOB, DOC, DOI, DOM, MDOB und TMA-2 im Urin untersucht. Um mögliche Interaktionen oder Einflüsse genetischer Polymorphismen abzuschätzen, wurde darüber hinaus untersucht, welche Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme die Hauptmetabolismusschritte katalysieren und ob die Drogen CYP2D6 inhibieren können. Die 2,5- Dimethoxyamphetamine wurden hauptsächlich durch O-Demethylierung in Position 2 bzw. 5 des Ringes oder durch Deaminierung gefolgt von Reduktion zum entsprechenden Alkohol metabolisiert. Weitere Metabolismusschritte waren die Seitenkettenhydroxylierung. Als Phase-II-Reaktionen konnten partielle Glucuronidierung oder Sulfatierung gefunden werden. Metabolite aus Kombinationen dieser Schritte konnten ebenso detektiert werden. Die derivatisierten Metabolite der Drogen aus den Hauptstoffwechselwegen (O-Demethylierung bei DOB, DOC, DOI, MDOB und TMA-2; Hydroxylierung bei DOM) waren die Zielsubstanzen im toxikologischen Nachweisverfahren. Für CYP2D6 konnte als einzige Cytochrom P450 Isoform eine Beteiligung an den Hauptstoffwechselwegen nachgewiesen werden. Neben der Verstoffwechselung der untersuchten Substanzen durch CYP2D6 konnten auch eine Hemmung dieses Enzyms durch diese Substanzen beobachtet werden. Es wurde gezeigt, dass keine der untersuchten Substanzen eine irreversible sondern eine kompetitive Hemmung bewirkte.
2008-12-18
2017-07-12T06:57:55Z
2008-12-18
2008
2008-12-18
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-19723
hdl:20.500.11880/21114
http://dx.doi.org/10.22028/D291-21058
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/211182019-01-10T08:03:04Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Phencyclidine derivatives — a new class of designer drugs : studies on the metabolism and toxicological analysis
Phencyclidin-Derivate — eine neue Klasse von Designerdrogen : Studien zum Metabolismus and zur toxikologischen Analyse
Sauer, Christoph
Maurer, Hans H.
ddc:500
Phencyclidinderivate
Synthetische Droge
GC-MS
LC-MS
Stoffwechsel
Cytochrom P-450
Designerdrogen
Metabolismus
phencyclidine derivatives
designer drugs
metabolism
In the presented studies, the phencyclidine-derived designer drugs PCEPA, PCMPA, PCEEA, PCMEA, and PCPr were investigated regarding their metabolism and their toxicological analysis in urine. Furthermore, CYP isoform dependence of the main metabolic step and characterization of their kinetic profile were elucidated. The phencyclidine derived compounds were mainly metabolized by O-dealkylation, followed by oxidation to the corresponding acid, hydroxylation of the cyclohexyl ring in different positions, hydroxylation of the phenyl ring, N-dealkylation, and combinations of these steps. Phase II reactions consisted of partial glucuronidation and/or sulfation of some phase I metabolites. In the case of PCEPA, PCMPA, PCEEA, and PCMEA, the target analytes for the toxicological analysis were the derivatized O-dealkyl metabolites and their hydroxy isomers. In case of PCPr they were the mono-hydroxy metabolites, dihydroxy isomers and N-dealkylated mono-hydroxylated isomers. The main metabolic step of PCEPA, PCMPA, PCEEA, and PCMEA was catalyzed by different CYP isoforms. In case of the O-dealkylation of PCMEA in humans simultaneous intake of potent CYP2B6 inhibitory drugs, might lead to a decreased clearance of PCMEA.
In dieser Dissertation wurden der Metabolismus und die Nachweisbarkeit der neuen Designerdrogen des Phencyclidin-Typs PCEPA, PCMPA, PCEEA, PCMEA und PCPr im Urin untersucht. Ferner wurden die die Hauptmetabolismusschritte katalysierenden Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme und ihr kinetisches Profil aufgeklärt. Die PCPs wurden hauptsächlich durch O-Dealkylierung gefolgt von Oxidation zur Carbonsäure, Hydroxylierung des Cyclohexylringes in unterschiedlichen Positionen, Hydroxylierung des Phenylringes, N-Dealkylierung und Kombinationen aus diesen Schritten metabolisiert. Als Phase-II-Reaktionen wurden partielle Glucuronidierung oder Sulfatierung einiger Phase-I-Metaboliten gefunden. Die derivatisierten Metaboliten der Drogen aus den Hauptstoffwechselwegen (O-Dealkylierung, O-Dealkylierung und Hydroxylierung bei; PCEPA, PCMPA, PCEEA, PCMEA; Monohydroxylierung, Dihydroxylierung, N-Dealkylierung und Monohydroxylierung bei PCPr) waren die Zielsubstanzen im toxikologischen Nachweisverfahren. Die metabolischen Hauptschritte von PCEPA, PCMPA, PCEEA, und PCMEA wurde von unterschiedlichen CYPs katalysiert. Im Falle der O-Dealkylierung des PCMEA im Menschen könnte eine gleichzeitige Einnahme von Substanzen, die CYP2B6 hemmen, zu einer verminderten Clearance von PCMEA führen.
2009-03-17
2017-07-12T06:57:56Z
2009-03-17
2008
2009-03-17
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-20770
hdl:20.500.11880/21118
http://dx.doi.org/10.22028/D291-21062
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/212172019-01-10T08:03:05Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Molekulare Signaturen im Blut von Patienten mit Bronchialkarzinomen
Molecular signatures in blood of lung cancer patients
Leidinger, Petra
Meese, Eckart
ddc:500
Kleinzelliges Bronchialkarzinom
Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom
Blutserum
Small RNA
Blutzelle
Autoimmunität
Autoantigen
Seroreaktivität Tumor-assoziierte Autoantigene Profiling microRNA
seroreactivity tumor associated autoantigens profiling microRNA
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Etablierung komplexer Autoantikörper- und miRNA-Expressionsprofile in peripherem Blut.
Mit Hilfe der Analyse von über 1800 Autoantigenen wurde die Genauigkeit für verschiedene vergleichende Klassifikationen bestimmt. Lungentumorpatienten konnten von gesunden Probanden mit einer Genauigkeit von 98% getrennt werden. Patienten mit niedrig-gradigen Lungentumoren wurden mit einer Genauigkeit von 93,41% von Gesunden getrennt. Eine Trennung von Patienten mit NSCLC bzw. SCLC von Gesunden erzielte Genauigkeiten über 95%. Die Trennung der Lungentumorpatienten von Patienten mit COPD erreichte eine Genauigkeit von 76,75%. COPD-Patienten wurden von Gesunden mit 97,60% Genauigkeit getrennt. Entsprechende Unterscheidungen bei diesen Erkrankungen waren mit anderen Biomarkern bisher nicht mit vergleichbaren Ergebnissen möglich.
Durch die Expressionsanalyse von über 800 miRNAs konnten Lungentumorpatienten mit einer Genauigkeit von 95,4% von Gesunden unterschieden werden. Insgesamt wurden in Blutzellen von Lungentumorpatienten 27 signifikant deregulierte miRNAs identifiziert. Mit vorliegender Studie konnten erstmals solide Tumoren anhand eines miRNA-Expressionsprofils in Blutzellen klassifiziert werden.
In vorliegender Arbeit konnten komplexe Autoantikörper- und miRNA-Expressionsprofile in peripherem Blut von Lungentumorpatienten etabliert werden. Mit diesen Profilen wurden vergleichende Klassifikationen mit hoher Genauigkeit erreicht.
The presented study aimed at the establishment of complex autoantibody and miRNA expression profiles in peripheral blood.
With the analysis of more than 1800 autoantigens, the accuracy of several classification tasks was determined.Lung cancer patients were differentiated from healthy subjects with an accuracy of 98%. Patients with low-grade lung cancer were differentiated from healthy subjects with an accuracy of 93.41%. The differentiation of patients with NSCLC or SCLC from healthy subjects reached an accuracy of more than 95%. The differentiation of lung cancer patients from patients with COPD reached an accuracy of 76.75%. COPD patients were differentiated from healthy subjects with an accuracy of 97.60%.
Until now, corresponding classifications with these diseases were not possible with comparable results with other biomarkers.
With the expression analysis of more than 800 miRNAs lung cancer patients were differentiated from healthy subjects with an accuracy of 95.4%. A total of 27 significantly deregulated miRNAs were identified. With the presented study, it was possible for the first time to classify solid cancer based on the miRNA expression analysis in blood cells.
In the presented work, we were able to establish complex autoantibody and miRNA expression profiles in peripheral blood of lung cancer patients. Using these profiles we were able to perform several classifications with high accuracy.
2009-11-20
2017-07-12T06:58:22Z
2009-11-20
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-25650
hdl:20.500.11880/21217
http://dx.doi.org/10.22028/D291-21161
ger
openAccess
Alle Ressourcen in diesem Repository sind urheberrechtlich geschützt
oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/214912019-01-10T08:03:06Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Studies on the phase I and II metabolism and the toxicological analysis of the alkaloids of the herbal drug of abuse Mitragyna speciosa Korth. (Kratom) using gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography coupled to low- and high-resolution linear ion trap mass spectrometry
Studien zum Phase I und II Metabolismus und die toxikologische Nachweisbarkeit der Alkaloide der pflanzlichen Droge Mitragyna speciosa Korth.(Kratom) mittels der Gaschromatographie und der Flüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung
Philipp, Anika-Anina
Maurer, Hans H.
ddc:500
Pflanzliche Droge
Stoffwechsel
Harn
GC-MS
LC-MS
Mitragyna speciosa
Kratom
Metabolismus
Mitragyna speciosa
Kratom
metabolism
In the presented studies, the herbal drug Kratom (Mitragyna speciosa) was investigated regarding its metabolism and its toxicological analysis in rat and human urine. Depending on the plant species and plant parts the three most abundant alkaloids of Mitragyna speciosa are MG, PAY and the MG diastereomer SG. Further alkaloids are the MG diastereomers SC and MC and ISO-PAY the diastereomer of PAY.
The diastereomers of MG and PAY were mainly metabolized by hydrolysis of the methylester in position 16 and O-demethylation of the 9-methyoxy group. Further steps were the O-demethylation of the 17-methoxy group, followed, via the corresponding aldehydes, by oxidation to carboxylic acids or reduction to the correspondent alcohols, and combinations of these steps. As metabolic phase II reactions, partial glucuronidation and sulfation were observed. The metabolism study showed that all diastereomers of MG and PAY were extensively metabolized in rats and humans with some differences, particularly in phase II metabolism. In the case of Kratom, the target analytes for the toxicological analysis were the derivatized MG parent substance, the 9-O-demethyl metabolite of MG, the free carboxy group metabolite of MG, and the 9-O-demethyl-16-carboxy metabolite of MG.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden der Metabolismus und die Nachweisbarkeit der pflanzlichen Droge Kratom (Mitragyna speciosa) im Urin von Ratte und Mensch untersucht. Abhängig von der Pflanzenspezies und den Pflanzenteilen sind die drei Hauptalkaloide der Pflanze Mitragyna speciosa MG, PAY und das MG Diastereomer SG. Weitere Alkaloide sind die MG Diastereomere SC und MC sowie ISO-PAY, das das Diastereomer von PAY ist.
Alle Diastereomere von MG und PAY wurden hauptsächlich durch Hydrolyse des Methylesters in Position 16 und durch O-Demethylierung in Position 9 metabolisiert. Weitere Metabolismusschritte waren die O-Demethylierung in Position 17, gefolgt über die Zwischenstufe der Aldehyde, die entweder durch Oxidation in Carbonsäuren oder durch Reduktion in die entsprechenden Alkohole überführt wurden und Kombinationen aus diesen Schritten. Als Phase-II-Reaktionen konnten partielle Glucuronidierung oder Sulfatierung gefunden werden. Die Metabolismusstudien in Ratte und Mensch haben gezeigt, dass alle Diastereomere von MG und PAY einer intensiven Metabolisierung unterlagen, die sich hauptsächlich im Phase II Metabolismus unterschieden haben. Im Falle einer Kratom Einnahme sind die Zielsubstanzen im toxikologischen Nachweisverfahren die derivatisierte Muttersubstanz MG, der 9-O-Demethyl Metabolit von MG, der freie Carbonsäure Metabolit von MG und der 9-O-Demethyl-16-Carboxy Metabolit von MG.
2011-07-05
2017-07-12T06:59:34Z
2011-07-05
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-40746
hdl:20.500.11880/21491
http://dx.doi.org/10.22028/D291-21435
eng
openAccess
Alle Ressourcen in diesem Repository sind urheberrechtlich geschützt
oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/215572019-01-10T08:03:06Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Phase II metabolism of 3,4-methylenedioxymethamphetamine : synthesis, analysis, and enantioselective in vitro and in vivo kinetics
Phase II Metabolismus von 3,4-Methylenedioxymethamphetamin : Synthese, Analytik und Enantioselektive in vitro und in vivo Kinetik
Schwaninger, Andrea Eva
Maurer, Hans H.
ddc:500
Ecstasy
Amphetamine
Stoffwechsel
In vitro
In vivo
Sulfatierung
Enantioselektivität
MDMA
phase II metabolism
glucuronidation
sulfation
in vitro
in vivo
controlled administration
In the presented studies, the phase II metabolism of MDMA was investigated in vitro and in vivo. Furthermore, evaluation with respect to a possible stereoselective phase I and II metabolism was performed. The in vitro data indicated that sulfation is the major conjugation step with regioselective preferences for position 3 of DHMA. Both MDMA phase I metabolites, DHMA and HMMA, showed inhibition potential towards dopamine sulfation with IC50 values likely to be reached after recreational MDMA doses. Inhibition of dopamine degradation occurring in the central nervous system could be another reason for the drug-induced irreversible damage to central nerve terminals associated with MDMA consumption. Enantioselectivity was observed for DHMA sulfation and HMMA glucuronidation, but not for HMMA sulfation. In vivo urinary data obtained from 10 participants following controlled placebo, low and high dose MDMA administration supported the results from the in vitro experiments. HMMA sulfate was shown to be the major urinary metabolite providing the longest detection time for MDMA consumption. Enantiomeric ratios of all metabolites showed steady increases of R-isomers as a function of ingestion time which should allow distinguishing between recent or earlier MDMA ingestion, at least after a single MDMA dose.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde der Phase II Metabolismus von MDMA in vitro und in vivo untersucht. Darüber hinaus wurden die Daten auf einen möglichen stereoselektiven Phase I und II Metabolismus hin ausgewertet. Die in vitro- Experimente haben gezeigt, dass die Sulfatierung die Hauptkonjugationsreaktion darstellt, wobei für DHMA eine Regioselektivität für die 3 Position beobachtet wurde. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass DHMA und HMMA die Sulfatierung von Dopamin hemmen können, mit IC50-Werten wie sie nach üblichem Gebrauch von MDMA erwartet werden. Diese Inhibition könnte, wenn sie im Zentralnervensystem auftritt, eine weitere Ursache für die MDMA-induzierte irreversible Schädigung von Neuronen sein. Die Sulfatierung von DHMA und die Glucuronidierung von HMMA, nicht aber die HMMA-Sulfatierung waren enantioselektiv. Die Ergebnisse der in vitro-Experimente wurden bestätigt durch in vivo Daten von 10 Teilnehmern, die im Rahmen einer kontrollierten MDMA-Studie jeweils ein Placebo, eine Niedrig- oder eine Hochdosis erhalten haben. HMMA-Sulfat war in vivo der Hauptmetabolit, der die längste Nachweisbarkeit einer MDMA Einnahme ermöglicht. Die Enantiomerenverhältnisse aller untersuchter Verbindungen zeigten eine stetige Zunahme der R-Enantiomere über die Zeit, was es erlauben sollte zwischen rezentem und länger zurückliegendem MDMA Konsum zu unterscheiden, zumindest nach einmaliger Einnahme.
2011-12-13
2017-07-12T06:59:50Z
2011-12-13
2011
2011-12-13
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45217
hdl:20.500.11880/21557
http://dx.doi.org/10.22028/D291-21501
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/217942023-03-21T14:30:12Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:ResearchDatainterface:dnbdoc-type:workingPaperddc:500ddc:620
CK2 kinase activity but not its binding to CK2 promoter regions is implicated in the regulation of CK2α and CK2β gene expressions
Lupp, Sarah
Gumhold, Catalina
Ampofo, Emmanuel
Montenarh, Mathias
Rother, Karen
ddc:500
Proteinkinase CK2
Genexpression
Transkription <Genetik>
DNS-Bindung
Transkriptionsregulation
DNA-Bindung
protein kinase CK2
gene expression
transcriptional regulation
DNA binding
Protein kinase CK2, a ubiquitous serine/threonine kinase in control of a variety of crucial cellular functions, is composed of catalytic a- and a0-subunits and non-catalytic b-subunits which form holoenzymes such as CK2(ab)2, CK2aa'b2, or CK2(a'b)2. In addition, there is sample evidence for the occurrence of the individual subunits beside the holoenzyme. While the CK2 subunits are well analyzed on the protein level, only little is known about the regulation of their transcription. The existence of multiple forms of CK2 subunits raised the question about a mutual regulation of their expression. Here we defined two 50-upstream regions of the CK2alpha and the CK2beta genes, respectively, as sequences with promoter activities. We found that CK2alpah and CK2alpha' stimulated the expression of the reporter constructs whereas, CK2beta was inactive. Using chromatin immunoprecipitation assays, we were unable to detect binding of endogenous CK2 subunits to these promoter sequences in vivo. However, it turned out that inhibition of the kinase activity of CK2 attenuated the promoter activity indicating that CK2alpha and CK2alpha' might regulate their gene expression indirectly by phosphorylation reactions. Thus, we have shown here (i) that under normal physiological conditions CK2 does not bind to CK2 promoter regions and (ii) that the CK2 kinase activity is implicated in the regulation of its own expression.
2013-09-27
2017-07-12T07:00:50Z
2013-09-27
2013
2013-09-27
doc-type:workingPaper
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-55052
hdl:20.500.11880/21794
http://dx.doi.org/10.22028/D291-21738
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/219392019-01-10T08:03:07Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Regulation der U3-, U8- und U13snoRNA-Expression durch Ddx5 und Ddx17
Regulation of U3, U8- and U13snoRNA-expression by DDX5 and Ddx17
Ismael, Hala
Stahl, Hans
ddc:500
DEAD-box-Proteine
Helicasen
Promotor <Genetik>
Ddx5 Ddx17
helicase
snoRNAs (kleine nucleoläre RNAs) tragen im Verbund mit assoziierten Proteinen (snoRNPs genannt) zur Reifung ribosomaler RNAs, Transfer-RNAs und anderer Transkripte bei. Die meisten snoRNPs tun dies, indem sie die Basen ihrer Substrat-RNAs chemisch modifizieren; wenige andere werden für die strukturelle Organisation der reifenden Primärtranskripte benötigt. Zu diesen zählen die snoRNPs, deren RNA-Anteile durch die hier untersuchten C/D snoRNAs U3, U8 und U13 gebildet werden. Über die Regulation der Expression dieser snoRNAs ist wenig bekannt. Nach einem Knock-down von Ddx5/Ddx17 wurde ein deutlicher Anstieg der U3-, U8- und U13snoRNA Konzentrationen in HeLa-Zellen beobachtet. Als Ursache hierfür konnte eine Transkriptionssupression durch Ddx5/Ddx17 nachgewiesen werden, die Promotor abhängig und an der HDAC1 beteiligt ist. Der biologische Sinn dieser Transkriptionsregulation ist unklar, könnte aber mit der Funktion von Ddx5/Ddx17 bei der Zellproliferationkontrolle zusammenhängen. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass auch die durch Ddx5/17 regulierten snoRNAs bei Säugern für die Zellvermehrung und überlebenfähigkeit erforderlich sind. Mehr noch, es wurde gefunden, dass die U3snoRNA aufgrund einer Ago2-Interaktion in „RNA-induced silencing complexes“ (RISC) vorliegt, was auf eine miRNA-ähnliche Funktion hindeutet. Die 3´UTR der A kinase anchor protein 9 (AKAP 9)-mRNA konnte als potentielles Target einer solchen Funktion identifiziert werden.
Small nucleolar RNAs (snoRNAs) in cooperation with their associated proteins (snoRNPs) contribute to the maturation of ribosomal RNAs, transfer RNAs and other transcripts. Most snoRNPs mediate chemical base modifications of their substrate RNAs, few others are needed for the structural organization of maturing primary transcripts. Among the latter, those organized by the C/D snoRNAs U3, U8, U13 are studied is this dissertation. Our knowledge about the regulation and the expression of these snoRNAs is limited, and in this study, significant increase in the concentrations of U3-, U8-, and U13snoRNA are observed after a Knock-down of Ddx5/Ddx17 in HeLa cells. These alterations are shown to be caused by transcriptional suppression mediated by Ddx5/Ddx17 and HDAC1 in a promoter dependent way. The biological significance of this observation is unknown but may be related to the functional control of Ddx5/Ddx17 in cell proliferation. The U3-, U8-, and U13snoRNA, in deed, are shown here to be essential for proliferation and viability of human cells as well. Moreover, it was found that the U3snoRNA interacts with Ago2 in RNA-induced silencing complexes (RISC), pointing to a miRNA-like function of this snoRNA. The 3´UTR of the A-kinase anchor protein 9 (AKAP 9)-mRNA could be identified as a potential target of such a miRNA-like function.
2015-01-29
2017-07-12T07:01:35Z
2015-01-29
2014
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-59930
hdl:20.500.11880/21939
http://dx.doi.org/10.22028/D291-21883
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/222002019-01-10T08:03:08Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Development of an ultra high performance liquid chromatographic-tandem mass spectrometric multi-analyte approach for target screening in eight different matrices and quantification in three different matrices
Entwicklung eines UHPL-MS/MS Multi-Analyten Verfahrens für das Screening in 8 verschiedenen biologischen Matrizes und Quantifizierung in drei verschiedenen biologischen Matrizes
Montenarh, Deborah
Maurer, Hans H.
ddc:500
Screening
Benzodiazepine
Quantifizierung
screening
matrices
quantification
benzodiazepine
In the present dissertation, the development of a multi-analyte multi-biosample LC-MS/MS approach with simple extraction is described for the screening and identification of over 100 analytes in eight different matrices. The analytes were extracted with one single liquid-liquid work-up approach from eight different matrices and separated with one column and one multi-reaction mode (MRM) method. In addition, three methods for quantification of 19 benzodiazepines including Z-drugs, 33 antidepressants, and 33 neuroleptics in three different matrices were developed, fully validated, and the results evaluated concerning cross calibration. The present studies showed that matrix effects and recovery results in different biosamples have an influence on the cross calibration between these biosamples. The applicability of the presented method was shown using authentic human samples and external quality control samples. Especially for the group of antidepressants, it was shown that cross-calibration between different biosamples could only be used for some analytes.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine LC-MS/MS Methoden für schnelles Screening von rund 100 Arzneistoffen und Drogen in acht verschiedenen Matrizes entwickelt. Für diese Vielzahl an Substanzen und Untersuchungsmaterialien wurden ein einziger Extraktionsansatz sowie eine analytische Säule und eine MRM-Methode zur Trennung verwendet. Zusätzlich wurden für die Quantifizierung von 19 Benzodiazepinen einschließlich sogenannter Z-Drugs, 33 Antidepressiva und 33 Neuroleptika in drei verschiedenen Blutpräparationen neue LC-MS/MS Methoden entwickelt, nationalen Richtlinien validiert und die Ergebnisse bezüglich Kreuz-Kalibration ausgewertet. Hierbei zeigte sich, dass Probleme mit Matrixeffekten und der Extraktionsausbeute bei einigen Substanzen in verschiedenen Untersuchungsmaterialien einen Einfluss auf die Kreuz-Kalibrierung zwischen diesen Untersuchungsmaterialien haben. Die Anwendbarkeit des vorgestellten Verfahrens wurde anhand authentischer Untersuchungsproben und externen Qualitätskontrollproben bestätigt. Vor allem für die Substanzklasse der Antidepressiva wurde gezeigt, dass die Kreuz-Kalibrierung zwischen verschiedenen biologischen Matrizes nur für ausgewählte Substanzen in Betracht gezogen werden kann.
2016-05-09
2017-07-12T07:02:42Z
2016-05-09
2015
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-65028
hdl:20.500.11880/22200
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22144
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/222312022-04-05T12:18:45Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Intracellular Ca2+ content and phosphatidylserine exposure in human red blood cells
Wesseling, Mauro Carlos
Bernhardt, Ingolf
ddc:500
Durchflusscytometrie
Blutzelle
Calciumkonzentration
Phosphatidyl-serin
Fluoreszenzmikroskopie
Eryptose
Lysophophatidsäure
rote Blutzelle
red blood cells
Ca2+ content
phosphatidylserine exposure
flow cytometry
fluorescence imaging
Ca2+ uptake as well as PS exposure in RBCs has been activated with different substances: lysophosphatidic acid (LPA), phorbol-12 myristate-13 acetate (PMA, activator of the PKC), and A23187 (Ca2+ ionophore, used as positive control). Measurement techniques included flow cytometry and live cell imaging (fluorescence or confocal microscopy).
PS exposure is not solely based on the increased intracellular Ca2+ content. Ca2+ activates the scramblase. In addition, we were able to show that the PKC as well as Ca2+-activated K+ channel play substantial role in the process of PS exposure.
Ca2+ uptake and PS exposure do not depend on the cell age. Quantitative discrepancies with respect to results obtained by different investigators and also with respect to the LPA batches used have been observed. In addition, we realized differences comparing the results of single and double labelling experiments (for Ca2+ and PS). The results are also affected by the fluorescent dye used.
The reason for existing RBCs showing PS exposure but without increased Ca2+ content is do to cell membrane damage and loss of Ca2+ and/or Ca2+ with fluorescent dye shortly before eryptosis. RBCs with increased Ca2+ content but without PS exposure is probably depending on the cell shape (echinocytes show significantly less PS exposure than discocytes or stomatocytes). This result suggests that the shape of the RBCs plays a substantial role for the PS exposure.
Die Ca2+-Aufnahme und die PS-Exposition in humanen roten Blutzellen (RBCs) wurde durch verschiedene Substanzen aktiviert: Lysophosphatidsäure (LPA), Phorbol-12 myristat-13 acetat (PMA, Aktivator der PKC) und A23187 (Ca2+-Ionophor, Positivkontrolle). Die Messmethoden beinhalteten Durchflusszytometrie und Fluoreszenz- bzw. Konfokal-Mikroskopie.
Die PS-Exposition basiert nicht nur auf einer erhöhten intrazellulären Ca2+-Konzentration. Ca2+ aktiviert die Scramblase. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass sowohl die PKC als auch der Ca2+-aktivierte K+ Kanal eine substanzielle Rolle im Prozess der PS-Exposition spielen. Die Ca2+-Aufnahme und die PS-Exposition hängen nicht vom Zellalter ab.
Quantitative Unterschiede von Messdaten, die von unterschiedlichen Experimentatoren und mit unterschiedlichen LPA-Chargen erzielt wurden, konnten erklärt werden. Zusätzlich konnten Unterschiede der Ergebnisse, die auf der Basis von Einzelfärbungs- und Doppelfärbungs-Experimenten (für Ca2+ und PS) erzielt wurden, aufgeklärt werden. Die Resultate werden auch durch die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe beeinflusst. Der Grund dafür, dass es einige RBCs gibt, die eine PS-Exposition aber keinen erhöhten Ca2+-Gehalt aufweisen, basiert wahrscheinlich auf einer beginnenden Schädigung der Membran unmittelbar vor der Eryptose, was zu einem Verlust an Ca2+ und/oder Ca2+ mit Fluoreszenzfarbstoff führt. Die Existenz von RBCs mit erhöhtem Ca2+-Gehalt, aber ohne PS-Exposition, basiert wahrscheinlich auf der Zellform (Echinozyten haben eine geringere PS-Exposition als Discozyten oder Stomatozyten). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Form der RBCs eine substanzielle Rolle für die PS-Exposition spielt.
2016-08-12
2017-07-12T07:02:50Z
2016-08-12
2016
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-66059
hdl:20.500.11880/22231
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22175
eng
openAccess
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/223862019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Establishment and characterization of an epithelial cell culture model for the respiratory tract relevant for in vitro studies of pulmonary drug absorption, targeting and development
Etablierung und Charakterisierung eines epithelialen Zellkulturmodells für den Respirationstrakt, relevant für in vitro-Studien pulmonaler Arzneistoffabsorption, gezielter Wirkstofffreisetzung und Arzneistoffentwicklung
Steimer, Anne
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
P-Glykoprotein
Zellkultur
Arzneimittel
Absorption
Epithel
Atemwege
Wirkstofffreisetzung
Arzneimittelforschung
alveolare Epithelbarriere
Pneumozyten aus Schweinelunge
Permeabilitäts-Studien
pulmonale Arzneistoff-Absorption
alveolar epithelial barrier
primary porcine lung pneumocytes
P-glycoprotein
permeability studies
pulmonary drug absorption
The presented thesis describes the establishment of a cell culture model, which can serve as a screening tool in pharmaceutical research studying drug application to the lungs. It starts with a review, which gives an extensive overview on currently available cell culture models of the respiratory tract.
Cells were isolated from procine lung, grown as primary cultures on filter supports and identified as porcine alveolar epithelial cells (pAEpC). These cells grew to confluent monolayers with typical intercellular junctions. During the cultivation process, a change from heterogeneous morphology towards a monolayer predominated by type I and type II pneumocytes was observed. A maximal transepithelial resistance of about 2000 Ohm*cm² demonstrated the formation of a tight epithelial barrier. Permeation of marker compounds was reproducible throughout several cell preparations and the model proved successful in distinguishing between low and high permeable drugs. Based on these results quality control parameters were defined serving as threshold for the use of pAEpC monolayers in transport studies. Budesonide and triamcinilone acetonide were selected for permeation experiments, as examples for commercially available drugs, which are commonly administered to the lungs. Expression of P-glycoprotein (P-gp) was confirmed on protein level, although permeability studies revealed no polarity in transport of known P-gp substrates.
The porcine alveolar epithelial primary cell culture shares major hallmarks of the mammalian alveolar epithelium and it is easily available and scaled up for drug screening. Filter-grown monolayers of pAEpC can be used to study drug transport across such artificial alveolar epithelium and may represent a suitable in vitro model for pulmonary drug absorption and delivery.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines Zellkulturmodells, das in der Pharmaforschung zum Studium pulmonal applizierter Arzneistoffe eingesetzt werden kann. Einleitend wird ein ausführlicher Überblick über weitere in vitro Modelle des Respirationstraktes gegeben.
Aus der Schweinelunge isolierte Zellen wuchsen als Primärkultur auf Filtern und konnten als pulmonales Alveolarepithel (pAEpC) identifiziert werden. Sie entwickelten konfluente Monolayer mit typischen interzellulären Kontakten, wobei im Kulturverlauf aus einer zunächst morphologisch heterogenen Kultur eine Zellpopulation aus vornehmlich Typ I und Typ II Pneumozyten entstand. Ein elektrischer Widerstand von bis zu 2000 Ohm*cm² belegte die Ausbildung einer dichten Barriere. Permeations-Experimente über pAEpC Monolayer erlaubten eine Unterscheidung zwischen hoch- und niederpermeablen Arzneistoffen, auch bei Verwendung von Kulturen unterschiedlicher Präparationschargen. In diesem Rahmen wurden Parameter zur Qualitätskontrolle definiert, die als Grenzwert für den Einsatz von pAEpC Monolayern in Transportstudien dienten. Als Beispiele für kommerziell verfügbare Arzneistoffe, die über die Atemwege appliziert werden, wurden Budesonid und Triamcinolonacetonid untersucht. Die Expression von P-Glykoprotein wurde auf Protein-Ebene bestätigt, obwohl der Transport bekannter P-gp-Substrate in Permeabilitäts-Studien keine Polarität zeigte.
Alveolare Schweine-Epithelzellen in Primärkultur weisen typische Merkmale des Alveolarepithels von Säugetieren auf. Sie sind leicht und in größerer Menge verfügbar, wie es für eine frühe Selektion potentieller Arzneistoffe erforderlich ist. Auf permeablen Filtermembranen kultivierte Monolayer können zu Transportstudien über solch ein künstliches Alveolarepithel genutzt werden und stellen ein geeignetes in vitro Modell für die Untersuchung pulmonaler Arzneistoff-Absorption und der Freisetzung am Wirkort dar.
2006-08-17
2017-07-12T07:25:18Z
2006-08-17
2006
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-6517
hdl:20.500.11880/22386
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22330
eng
openAccess
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224092019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Examination of the penetration behavior of pharmaceutical drugs on the eye and set-up of an in virto cell model for ocular drug delivery
Untersuchung des Penetrationsverhaltens von Arzneistoffen am Auge und Etablierung eines in-vitro Zellkulturmodells für okulare Arzneistofffreigabe
Becker, Ulrich
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Penetration
Auge
Hornhaut
Arzneimittel
Zellkultur
Vergleich
Multidrug-Resistenz
In vitro
Moxaverin-Hydrochlorid
humanes Primärzellmodell
penetration test
cornea
cell culture
multi-drug resistance
moxaverine-hydrochloride
The focus of this thesis was to find a simple test system to screen new therapeutic entities to regarding their ocular penetration. Using the model compound moxaverine-hydrochloride, the project was performed in 4 phases:
In phase 1, the tissue distribution of moxaverine-hydrochloride in the rabbit eye was examined and evaluated. A distribution profile was generated by either dosing pigmented Dutch-belted rabbits topically on the eye or applying the drug solution intravenously. Results showed that high drug amounts in the posterior part of the eye can be achieved after pre-corneal disposition of the moxaverine-solution. The fact that blood-plasma levels of moxaverine-hydrochloride did not exceed the levels found after systemic dosing makes local ocular administration of moxaverine-hydrochloride an interesting therapeutic approach.
Parallel to the in vivo testing, the barrier that corneal epithelium exhibits towards moxaverine-hydrochloride was examined using a primary rabbit corneal epithelial cell culture (rbCECL). These in vitro drug transport studies confirmed that the rabbit cornea does not represent a critical barrier for moxaverine-penetration into the eye.
Phase 2 of the presented project dealt with the development of a primary human corneal epithelial cell model.
The methods mainly concentrated on various enzymatic digestions, using proteases and combination of these enzymatic techniques with a cell positive selection protocol using magnetic microbeads coated with human epithelial antigen (CD327, HEA-125). Even though the experimental conditions were varied intensively and numerous combinations of enzymes were examined, the aim of the primary human corneal epithelial cell culture was not reached. The limited amount of available tissue and the long storage time of the corneal samples after excision might contribute to the failure of this part of the work.
Since a primary human corneal epithelium was out of reach as an in vitro test system, existing models of human corneal epithelium were examined and compared to intact human and rabbit cornea (phase 3 of the thesis). The cell models under investigation were all of human origin and immortalized by either SV-40 large T antigen or a recombinant retrovirus containing HPV16 genes E6 and E7. The cell models were examined by a spectrum of marker-substances for their power to differentiate (high/low permeability markers), presence and activity of P-glycoprotein efflux systems (using substrate molecules), and value for ophthalmic research ("ophthalmology marker';). The systems were also used to screen the substance of interest, moxaverine-hydrochloride.
Using a set of marker substances, a ranking of the models was created. The commercially available reconstituted human corneal epithelium from Skinethic (Nice, France) showed a poor performance in this study, even though it serves as a valuable tool in toxicity and eye irritation testing. The likewise commercially available Clonetics system from Cambrex as well as the long established HCE-T cell line proved to be good simplified models of the cornea. Drawbacks for the HCE-T cell line, however, is the less pronounced power of differentiation and the findings made in stage 4 of the project (see below).
In the final, fourth phase of the project, the HCE-T cell line was compared to the human cornea regarding its equipment with common efflux transporters. Since efflux systems of the ABC-transporter family are known to be a crucial factor in drug disposition and failure in cancer therapy, these proteins have gained major interest in biopharmaceutical research.
To clarify the situation in corneal epithelium that has not been extensively reviewed so far, we examined the presence of MDR1/P-gp, MRP1, MRP2, LRP, and BCRP in ex vivo human corneal samples and the commonly used HCE-T cell line. RT-PCR and immunofluorescence microscopy, as well as immunoblotting were used as tools to assess the spectrum of transporters.
Human cornea proved to be a rather uncritical tissue concerning multi-drug resistance issues, showing only a little array of efflux proteins, namely only LRP, HCE-T, however, showed a broader spectrum of efflux proteins, not unexpected in a continuously growing cell line that highly differs from the situation found ex vivo.
In dieser Arbeit sollte ein einfaches Testsystem gefunden werden, um das oculare Penetrationsverhalten neuer therapeutischer Substanzen vorhersagen zu können. Unter Verwendung der Modellsubstanz Moxaverin-Hydrochlorid wurde das Projekt in 4 Abschnitten durchgeführt:
In Phase 1 wurde die Gewebeverteilung von Moxaverin-Hydrochlorid im Kaninchenauge ermittelt und bewertet. Ein Verteilungsprofil wurde erstellt, indem pigmentierte Kaninchen der Rasse "dutch-belted'; eine Wirkstofflösung entweder lokal am Auge oder intravenös verabreicht wurde. Die Resultate zeigten, daß hohe Substanzmengen im hinteren Teil des Auges nach precornealer Verabreichung der Moxaverinlösung erreicht werden können. Die Tatsache, daß die Blutplasma-Spiegel des Moxaverin-Hydrochlorids die der systemischen Gabe nicht überstiegen, macht die lokale, okulare Gabe von Moxaverin-Hydrochlorid zu einer interessanten Therapiemöglichkeit für die vom Koopertionspartner vorgesehene Anwendungsgebiete. Parallel zur in vivo Testung wurden die Barriereeigenschaften des Korneaepithels gegenüber Moxaverin-Hydrochlorids mit einer primären Epithelzellkultur der Kaninchenkornea (rbCECL) überprüft. In vitro Arzneistofftransportstudien zeigten, daß das Kaninchenhornhautepithel keine kritische Barriere für die Moxaverinpenetration in das Auge darstellt.
Phase 2 der Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung eines primären humanen Korneaepithelzellmodells. Die angewandten Techniken bestanden hauptsächlich aus enzymatischen Verdau mittels verschiedener Proteasen, die bereits in der Literatur beschrieben wurden. Diese wurden mit einem Zell-Aufreinigungsverfahren kombiniert, das sich magnetischer Microbeads bedient. Diese sind mit einem menschlichem Epithelantigen (CD326, HEA-125) beschichtet und besitzen die Möglichkeit, spezifisch an humane Epithelzellen zu binden. Obwohl die experimentellen Bedingungen immer wieder variiert wurden und verschiedene Isolationstechniken kombiniert wurden, konnte das gesetzte Ziel der primären menschlichen Korneaepithelzellkultur nicht erreicht werden. Die begrenzte Menge des vorhandenen Gewebes und die lange Kulturzeit der Korneaproben nach Entnahme aus dem Spender trugen hierbei massgeblich zum Misslingen dieses Teils der Arbeit bei.
Da ein primäres menschliches Korneaepithel als in vitro Testsystem nicht verfügbar war, wurden bereits etablierte Modelle für das menschliche Korneaepithel mit intakter Menschen- und Kaninchenhornhaut verglichen (Abschnitt 3 des Projekts). Alle untersuchten Zellmodelle waren menschlichen Ursprungs und durch das SV-40 large T Antigen oder ein recombinantes Retrovirus, das die HPV16 Gene E6 und E7 enthielt, immortalisiert. Die Zellmodelle wurden mit einem Spektrum von Testsubstanzen auf ihre Differenzierungskapazität (hoher/niedriger Permeabilitätsmarker), das Vorhandensein von P-gp Effluxsystemen (mittels Substrattransportes) und Wert für die Augenforschung ("Ophthalmologiemarker") überprüft. Die Systeme wurden weiterhin als Screen für die Modellsubstanz, Moxaverin-Hydrochlorid, benutzt. Mittels dieser Markersubstanzen wurden die Zellmodelle klassifiziert. Das käuflich erhältliche rekonstituierte menschliche Korneaepithel von Skinethic (Nizza, Frankreich) zeigte nur eine niedrige Differenzierungsleistung, obwohl es ein wertvolles Testsystem im Bereich Augenreizung und Toxizitätsstudien darstellt. Das ebenfalls kommerziell erhältliche Clonetics System von Cambrex und die etablierte HCE-T Zelllinie waren gute vereinfachende Modelle der Hornhaut. Die HCE-T Zelllinie zeigte allerdings weniger ausgeprägte Unterscheidungskraft als das Clonetics System und die Resultate die in Phase 4 des Projektes (siehe unten) gefunden wurden, führten zu einer weiteren Rückstufung des Modells.
In der letzten, vierten Stufe dieser Arbeit wurde die HCE-T Zelllinie mit der menschlichen Hornhaut bezüglich der wichtigsten bekannten Effluxsysteme verglichen. Da die Effluxsysteme der ABC-Transporterfamilie sich als entscheidender Faktor in der Arzneistoffabsorption über biologische Barrieren herausgestellt haben und auch eine entscheidende Rolle in der Resistenzbildung von Tumoren in der Krebstherapie spielen ("mulit-drug resistance"), haben diese Proteine ein grosses Interesse in der biopharmazeutischen Forschung geweckt. Da es zum Expressionsmuster der ABC-Transporter in der menschlichen Hornhaut nur wenige und zudem widersprüchlich Aussagen gibt, wurde das Vorhandensein und die Aktivität von MDR1/P-gp, MRP1, MRP2, LRP und von BCRP in Humankornea mit in der vielgenutzten HCE-T Zelllinie verglichen. RT-PCR und Immunofluoreszenzmikroskopie, sowie Immunoblotting wurden hierbei als Methoden benutzt. Menschliche Hornhaut stellte sich hierbei als ein ziemlich unkritisches Gewebe bezüglich multidrug-resistance Proteinen dar und zeigte ein sehr eingeschränktes Spektrum an Effluxproteinen (LRP). HCE-T Zellen stattdessen besitzen ein breites Spektrum von Effluxtransportern, das sich in hohem Grade von der in vivo Situation unterscheidet.
2007-01-25
2017-07-12T07:25:29Z
2007-01-25
2006
2007-01-25
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-9461
hdl:20.500.11880/22409
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22353
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224132019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Combined assessment of dissolution and epithelial permeability of solid oral dosage forms
Kombinierte Bestimmung von Dissolution und epithelialer Permeabilität von festen oralen Arzneiformen
Motz, Stephan
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Permeabilität
Arzneimittel
Dissolution
Permeation
Caco-2 Zellen
Dissolution
Permeation
Caco-2 monolayer
Assessing dissolution and Caco-2 permeability to estimate the in vivo performance of solid oral dosage forms is done since decades. However, permeability assays applying Caco-2 monolayers exhibit the drawback that, in contrast to dissolution testing, a complete dosage form is not eligible for conventional epithelial permeability assays. Hence, an apparatus was developed providing the possibility to assess permeability of solid oral dosage forms based on combination of a Caco-2 monolayer and a flow through dissolution cell. Combination of the dissolution and permeation module was performed using a depressurized stream splitter. Experiments with varying propranolol HCl tablets yielded plausible and conclusive results. Furthermore, data of these experiments were used to perform computational modelling of the concentration time trends within the apparatus. In order to increase throughput and to decrease manpower, the apparatus was automated by means of sequential injection technique (SIA) permitting online sampling and drug quantification. Finally, experiments with furosemide, a BCS class 4 compound, were carried out.
In summary, a novel tool for has been developed, which is able to monitor influences of excipients concomitantly on both dissolution and permeability through the small intestinal cell line Caco-2.
Dissolutions- und Permeabilitäts-Tests werden seit längerem zur Abschätzung der Bioverfügbarkeit nach oraler Administration verwendet. Traditionelle, auf Caco-2 Zellmonolayern basierende Permeabilitätstest haben jedoch den Nachteil, daß man - im Gegensatz zu Dissolutionstests - nicht die komplette Arzneiform auf ihre epitheliale Permeabilität testen kann. Ausgehend davon wurde eine Testapparatur zur Permeabilitätsbestimmung fester oraler Arzneiformen entwickelt. Die Kombination Permeation- Dissolution wurde hierbei durch eine Verbindung der Module mit Hilfe eines druckfreien Stromteilers bewerkstelligt. Experimente mit verschiedenen Propranolol HCl Tabletten ergaben plausible und schlüssige Ergebnisse. Des weiteren wurden mit Hilfe der Daten aus diesen Experimenten die Konzentrations-Zeit Profile innerhalb der Testapparatur mittels eines computerbasierten Modells zu simuliert. Im Rahmen der Weiterentwicklung wurde die komplette Testapparatur automatisiert, so daß sowohl die Probennahme als auch die Arzneistoffquantifizierung programmiert ablaufen. Daneben wurden auch Experimente mit Lasix® Tabletten (40 mg Furosemid) durchgeführt.
Zusammenfassend kann die Testapparatur als neuartiges Werkzeug gesehen werden, welches die Sichtbarmachung der Einflüsse von Hilfsstoffen sowohl auf die Dissolution als auch auf die intestinale Permeation ermöglicht.
2007-03-01
2017-07-12T07:25:30Z
2007-03-01
2007
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-10237
hdl:20.500.11880/22413
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22357
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224152019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Identifizierung essentieller Komponenten des intrazellulären Transports eines viralen A/B-Toxins der Hefe
Identification of the intracellular transport system of a viral A/B-toxin in yeast
Sendzik, Tanja
Schmitt, Manfred J.
ddc:500
Saccharomyces cerevisiae
Hefeartige Pilze
Intrazellulärer Transport
Toxin
Ubiquitin
Endocytose
Hefe
Killertoxine
ERAD
Ubiquitinierung
Rezeptor-vermittelte Endozytose
yeast
ERAD
intracelluar transport
killertoxins
receptor-mediated endocytosis
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae sezerniert das von dsRNA Viren kodierte, heterodimere K28-Toxin in das sie umgebende Medium und ist somit in der Lage, Hefen derselben oder einer anderen Gattung abzutöten. Der als Präprotoxin (pptox) vorliegende Toxinvorläufer wird posttranslational in das ER-Lumen transportiert und nach Abspaltung der Signalsequenz werden die beiden Untereinheiten des reifen Toxins, α und β, durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Die Toxinaufnahme durch sensitive Zielzellen erfolgt über rezeptorvermittelte Endozytose, an deren Anschluss K28 retrograd über Golgi und ER bis auf die Stufe des Zytosols transportiert wird. Die Retrotranslokation aus dem ER erfolgt über den Sec61-Komplex der ER-Membran. Im Zytosol dissoziiert das α/β-Heterodimer in seine Toxinuntereinheiten, β wird ubiquitiniert und proteasomal abgebaut, während die zytotoxische α-Komponente mittels passiver Diffusion in den Zellkern gelangt und einen Zellzyklusarrest am G1/S-Übergang induziert. In der vorliegenden Arbeit wurden vier Themenschwerpunkte bearbeitet, die sich mit der intrazellulären Expression toxischer K28α-Derivate und deren intrazellulären Transportroute beschäftigten.
(1) Im Rahmen einer Transposon(mTn3)-Mutagenese konnten überwiegend nicht-essentielle Hefeproteine als potentielle Interaktionspartner der beiden toxischen α-Varianten α(SS/R) und α(NLS/R) identifiziert werden: APL3, CWP2, IRA2, PFK26, PRP6, RNH203 und ZWF1. Die toxischen α-Varianten wurden in den jeweiligen knock-out-Mutanten der betreffenden Gene intrazellulär exprimiert und zusätzlich gegen exogen appliziertes K28-Toxin getestet. Es stellte sich heraus, dass die beiden Proteine Prp6p und Apl3p potentielle Interaktionspartner von α darstellen könnten. Das Gen PRP6 wurde anhand des Konstruktes α(NLS/R)identifiziert. PRP6 kodiert den RNP(U4/U6)-assoziierten Spleißfaktor Prp6p, der am prä-mRNA-Spleißen beteiligt ist und sich in der Kernmatrix befindet. Prp6p könnte somit mit K28α im Kern in direkte Wechselwirkung treten, was die Theorie des Kernimportes unterstützt. Die Mutation des Genes ist letal, weshalb das Protein nicht weiter untersucht wurde, da keine Expressionsstudien damit durchgeführt werden konnten. Des Weiteren wurde mit α(NLS/R) das Gen APL3 identifiziert, was einen Hinweis auf einen gerichteten Kernimport von K28α lieferte. Bei Apl3p handelt es sich um einen Teil des an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligten AP2-Komplexes. Apl3p durchläuft ein nukleoplasmatisches "Shuttling". Auf dem Weg in den Zellkern könnte es mit der α-Untereinheit interagieren und eventuell dessen Import in den Nukleus erleichtern; alternativ wäre eine Interaktion nach passiver Diffusion von α(NLS/R) im Nukleus möglich. Interessanterweise verhielt sich die Δapl3-Mutante auch resistent gegen exogen appliziertes Toxin. Diese Resistenz beruht jedoch nicht auf einem Defekt der endozytotischen Toxin-Aufnahme (das Toxin war im Zytosol nachweisbar), sondern manifestiert sich vermutlich weiter "downstream", da sich die Mutante auch resistent gegen die Expression von α(SS/R) im ER verhielt.
(2) Mit Hilfe eines Mutanten-Screenings konnte untermauert werden, dass α(SS/R) in den Sekretionsweg der Zelle eingeschleust wird und die Signalpeptidaseaktivität im ER eine entscheidende Rolle für die Retrotranslokation und Toxizität spielt. Darüber hinaus wurden deutliche Hinweise dafür erbracht, dass α(SS/R) bis auf die Stufe des Golgi gelangt und anschließend wieder retrograd zum ER transportiert wird, was aus der Resistenz der Mutanten Δkex1, Δerv29, Δerv46, Δerv41, Δemp24, Δemp46 und Δbst1 nach intrazellulärer Expression von α(SS/R)gezeigt werden konnte. Zwei Möglichkeiten sind somit beim intrazellulären Transport der α-Untereinheit denkbar: α wird nach Erreichen des Golgi wieder retrotransportiert und aus dem ER in das Zytosol transloziert; im Zytosol angekommen, erfolgt eine passive Diffusion in den Kern, der eventuell eine Interaktion von α mit zytosolischen Proteine vorausgeht. Hinweise darauf lieferten die Nukleoporinmutanten Δnup60, Δnup84 und Δgfd1, die nach intrazellulärer Expression von α(SS/R) und α(NLS/R) resistent waren oder lediglich ein leicht verzögertes Wachstum zeigten. Eine weitere Alternative wäre, dass α im Fall von α(SS/R) direkt vom Golgi das Zytosol erreicht.
(3) Der intrazelluläre Nachweis der K28α-Untereinheit konnte erstmals anhand einer cmyc-markierten Toxinvariante (α(R)cmyc) erbracht werden. Die in vivo toxischen Varianten α(SS/R)cmyc und α(NLS/R)cmyc wurden weder im Zellaufschluss noch im Kulturüberstand nachgewiesen. Die durchgeführten Versuche ließen in Übereinstimmung mit den Mutantenanalysen den Schluss zu, dass α(SS/R) in den Sekretionsweg geschleust werden muss, um seine toxische Wirkung entfalten zu können; α(NLS/R) hingegen gelangt aufgrund der NLS direkt in den Kern; übereinstimmend hiermit war α(R) nicht mehr toxisch. (4) Der Austausch aller Lysinreste innerhalb von K28pptox gegen Arginine lieferte K28—Derivate mit einer verminderten Sekretionsrate und einer dadurch bedingten verminderten Toxizität. Die Lysin-freien Varianten waren jedoch in der Lage, den Zellen eine protektive Immunität zu verleihen. Eine Erhöhung der Toxizität war in den K-0 Varianten von K28 nicht zu beobachten, so dass eine Ubiquitinierung bei der Vermittlung der Toxizität keine Rolle spielt.
K28 killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae secrete a heterodimeric killer toxin (K28) which is genetically encoded by dsRNA viruses persisting within the cytosol. The toxin kills sensitive strains of the same or related genera by cell-cycle inhibition. The toxin precursor (preprotoxin, pptox) is postranslationally imported into the ER. On its intracellular transport route through ER and Golgi, the pptoxsignal sequence is proteolytically cleaved within the ER, and the α- and β-subunits of the mature toxin are covalently linked by a single disulfide bridge. Toxin uptake by a sensitive target cell resembles receptor-mediated endocytosis followed by retrograde transport via Golgi and ER and translocation into the cytosol through the major ER-import and -export channel Sec61p. Within the cytosol, the two subunits dissociate, β is ubiquitinated and proteasomally degraded, while α diffuses into the nucleus and induces a cell cycle arrest at the G1/S-boundary. The located HDEL-sequence is responsible for the endocytotic uptake and represents a classical ER retention signal which is recognized and bound by the HDEL-receptor Erd2p of the target cell. The subjects being worked on within this thesis cope with the intracellular expression and transport of certain toxic K28α-variants. The method of mTn3-mutagenesis was supposed to shed light onto intracellular interaction partners of the K28α-subunit. These partners should be investigated with respect to their cellular function. Moreover, an intensive mutant screening should show which compartments and modifications are necessary to confer α into its cytotoxic conformation. We also tried to detect the α-subunit intracellularly and in the supernatant. We asked whether there is any difference between the intracellular way the toxic subunit takes and the way "normal'; toxin follows when exogenously applied. Finally we focused on different toxin variants that were modified by the exchange of their lysine residues against arginine to analyze the effect of ubiquitination on toxin retrotranslocation and in vivo toxicity.
(1) By transposon(mTn3)mutagenesis several yeast genes could be identified whose gene products might be potential interaction partners of the suicidal α-variants α(SS/R) and α(NLS/R): APL3, CWP2, IRA2, PFK26, PRP6, RNH203 and ZWF1. The lethal α-derivatives were expressed in each knock-out mutant and, additionally, each mutant was tested for sensitivity/resistance against extracellularly applied K28-toxin. After intracellular expression of the two α-variants, Apl3p and Prp6p were identified as potential interaction partners of α. Prp6p is an essential gene product that plays a role within the snRNP(U4/U6)-associated splicing factor located in the nuclear matrix and involved in pre-mRNA-splicing. It is< known that Prp6p interacts with a wide range of proteins, including the ubiquitin ligase Ubc9p, and it might be possible that Prp6p interacts with K28α in the nucleus, supporting the necessity of nuclear import for in vivo toxicity of K28. Besides Prp6p, another yeast protein (Apl3p) could be identified as possible interaction partner of α(NLS/R) and α(SS/R). As of the AP2-complex, Apl3p is associated with the clathrin dependent endocytosis machinery. Apl3p undergoes a nucleoplasmatic shuttling and therefore could interact with α on its way to the nucleus and facilitate its nuclear import; alternatively, an interaction could take place within the nucleus. Interestingly, a Δapl3-knock-out was not only resistant against the intracellular expression of either α(NLS/R) or α(SS/R) but also against exogenously applied toxin. Toxin resistance in a Δapl3-mutant was not caused by a defect in endocytic toxin uptake, since toxin was detectable in the cytosol of toxin-treated mutant cells. Thus, its resistance is likely to be manifested downstream from endocytosis, presumably within the nucleus.
(2) Phenotypic analysis of various yeast mutants strongly indicated that α(SS/R) is transported into the ER lumen where signal peptidase processing is crucial for the in vivo toxicity of α. Furthermore, strong evidence was obtained that the variant α(SS/R) even reaches the Golgi compartment from where it is transported retrograde back to the ER. The following yeast knock-out mutants showed complete resistance against the intracellular expression of lethal K28α-variants: Δkex1, Δerv29, Δerv46, Δerv41, Δemp24, Δemp46 and Δbst1. Thus, two possible intracellular transport routes for K28α can be postulated: either α is transported from the Golgi back to the ER and thereafter into the cytosol from where it diffuses into the nucleus to kill a cell. Such a pathway is supported by the observed toxin resistance in the yeast nucleoporine mutants Δnup60, Δnup84 and Δgfd1 after intracellular expression of either α(SS/R) or α(NLS/R). Alternatively, α(SS/R) directly translocates from the Golgi to the cytosol to reach the nucleus.
(3) For the first time, after expression of a cmyc-tagged, non-toxic α-variant (α(R)cmyc) the subunit could be detected by western analysis. Neither the toxic variant α(SS/R)cmyc nor α(NLS/R)cmyc could be detected within the cell cytosol or in the cell-free culture supernatant. These tests, in addition to the mutant screen, also showed that α(SS/R) has to gain access to the secretory pathway in order to be converted into its cytotoxic conformation; in contrast, α(NLS/R) directly enters the nucleus via its NLS.
(4) Substitution of all internal lysine residues within K28pptox by arginines resulted in a toxin variant that was still in vivo toxic and capable to translocate from the ER into the cytosol, while immunity of lysine-free pptox was negatively affected. Therefore it can be concluded that ubiquitination is neither involved in ER exit nor in in vivo toxicity of K28.
2007-03-07
2017-07-12T07:25:31Z
2007-03-07
2006
2007-03-07
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-9128
hdl:20.500.11880/22415
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22359
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224172019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Film forming polymeric solutions as drug delivery systems for the skin
Filmbildende Polymerlösungen als Darreichungsform für die Haut
Zurdo Schröder, Ines
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Haut
Therapeutisches System
Filmbildung
Polymerlösung
skin
film forming
drug delivery
polymeric solution
The aim of this thesis was to develop and investigate film forming polymeric solutions as a novel delivery system for the skin. These solutions form very thin, flexible and almost invisible films on the skin which can serve as a reservoir for the transdermal delivery of drugs. In a first step various excipients were studied and formulation experiments were performed to provide the technological basis for the new delivery system. Compositions with different polymers were identified that provided suitable properties for the intended application (short drying time, low viscosity, permanence on the skin). Methods for the evaluation and characterization of the novel dosage form were developed and assessed. The drug delivery from the film forming systems through human epidermis was investigated with caffeine as model drug and steroidal hormones as therapeutically relevant compounds. The impact of different parameters on the drug permeation from the polymeric system was tested. Among these parameters were the nature of the solvent, the drug concentration or the incorporation of chemical enhancers. Finally, comparative in vitro and in vivo studies with registered transdermal patches were carried out to assess the drug delivering potential of the new dosage form for steroidal hormones. The obtained results have demonstrated that film forming polymeric solutions are a promising approach for transdermal drug delivery that should be pursued further in the future.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, filmbildenden Polymerlösungen als neue Arzneiform für die Haut zu entwickeln und zu untersuchen. Diese Lösungen bilden auf der Haut sehr dünne, flexible und nahezu unsichtbare Filme, die als Reservoir für die transdermale Wirkstoffapplikation dienen können. In einem ersten Schritt wurden verschiedene Hilfsstoffe getestet und Formulierungsversuche durchgeführt, um eine technologische Basis für die neue Darreichungsform zu schaffen. Zubereitungen mit verschiedenen Polymeren wurden identifiziert, die geeignete Eigenschaften für die beabsichtigte Anwendung aufwiesen (kurze Trocknungsdauer, geringe Viskosität, Nachhaltigkeit auf der Haut). Methoden zur Evaluierung und Charakterisierung der Formulierungen wurden entwickelt und bewertet. Die Wirkstoffverabreichung aus den filmbildenden Systemen durch Humanepidermis wurde mit der Modellsubstanz Koffein sowie mit therapeutisch relevanten steroidalen Hormonen untersucht. Der Einfluss verschiedener Parameter auf die Wirkstoffpenetration aus den Polymersystemen wurde getestet. Zu diesen Parametern gehörten die Art des Lösungsmittels, die Wirkstoffbeladung und die Gegenwart von chemischen Penetrationsverbesserern. Schließlich wurden vergleichende Untersuchungen mit zugelassenen transdermalen Pflastern durchgeführt, um das Potential der neuen Arzneiform hinsichtlich der Wirkstoffverabreichung einschätzen zu können. Die erzielten Ergebnisse haben gezeigt, dass filmbildende Polymerlösungen ein vielversprechender Ansatz für die transdermale Wirkstoffgabe sind, der in Zukunft weiterverfolgt werden sollte.
2007-03-12
2017-07-12T07:25:31Z
2007-03-12
2007
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-10443
hdl:20.500.11880/22417
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22361
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224202019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Hybridinhibitoren der humanen 5-alpha-Reduktase : ein neues Konzept zur Hemmung der 5-alpha-Reduktase Isoenzyme Typ I und Typ II
Hybrid inhibitors of human 5-alpha-reductase : a new concept for the inhibition of 5-alpha-reductase isoenzymes type I and type II
Streiber, Martina
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Enzym
Enzyminhibitor
Pharmakokinetik
Ester
Hydrolyse
Prostatakrebs
5-alpha-Reduktase
Benigne Prostatahyperplasie
Esterhydrolyse
Duale Inhibitoren
5-alpha-reductase
benign prostatic hyperplasia
prostate cancer
hydrolysis of esters
dual inhibitors
Erhöhte DHT-Spiegel korrelieren mit der Pathogenese und Progression androgenabhängiger Erkrankungen wie Prostatakrebs und benigner Prostatahyperplasie (BPH). Die irreversible Reduktion von T zu DHT stellt den letzten Schritt in der Androgenbiosynthese dar und wird von den beiden Isoenzymen 5-alpha-Reduktase 1 (5aR1) und 5-alpha-Reduktase 2 (5aR2) katalysiert. Zur Therapie der BPH werden deshalb 5aR Inhibitoren erfolgreich eingesetzt. Der Nutzen von 5aR Hemmstoffen zur Prävention von Prostatakrebs oder dessen Behandlung in Kombination mit Antiandrogenen wird zur Zeit in verschiedenen klinischen Studien untersucht. Dabei hat sich generell die Hemmung beider 5aR Isoenzyme als vorteilhafter erwiesen. Auf dem Arzneimittelmarkt sind nur 2 steroidale 5aR Hemmstoffe zugelassen, Finasterid und Dutasterid, wobei es sich nur bei letzterem um einen dualen Hemmstoff handelt. Wegen der unerwünschten Nebenwirkungen dieser 5aR Hemmstoffe, die mit der steroidalen Struktur einhergehen könnten, wurden in unserem Arbeitkreis nicht steroidale Inhibitoren entwickelt, die möglichst auch eine dualen Hemmung aufweisen sollten.
Potente, nicht steroidale 5aR2 Inhibitoren (4-[1-(2,2-Dicyclohexyl-acetyl)-piperidin-4-ylidenmethyl]-benzoesäuren) wurden auf Selektivität gegenüber der 5aR1 getestet werden. Dazu wurde ein Assay mit DU145 Zellen (humane Prostatakarzinom-Zellen, die 5aR1 exprimieren) verwendet, in dem die Substanzen keine Hemmung zeigten. Allerdings konnte für die Verbindungen eine schlechte Permeation in DU145 Zellen nachgewiesen werden, die wahrscheinlich mit der bei physiologischem pH-Wert deprotonierten Carbonsäure-Struktur in Zusammenhang steht. Um diese negative Ladung zu umgehen, wurde ein Konzept entwickelt, bei dem die korrespondierenden Methylester als zellpermeable Prodrugs eingesetzt wurden.
Um künftig solche Permeationseinflüsse im verwendeten Testsystem für die 5aR1 zu umgehen, wurde ein zellfreier DU145 Assay entwickelt. Interessanterweise zeigten nun die Methylester eine eigene Hemmwirkung am freien Isoenzym 1, was sie nicht nur zu Prodrugs der 5aR2 aktiven Säuren macht, sondern auch gleichzeitig zu Inhibitoren der 5aR1.
Aus dieser besonderen Art der dualen Hemmung beider 5aR Isoenzyme wurde nun ein völlig neues Hybridinhibitor-Konzept entwickelt. Der Ester sollte als Precursor für die korrespondierende Säure und gleichzeitig als selektiver Inhibitor der 5aR1 dienen und daher während seiner Absorption und Verteilung im menschlichen Körper hydrolyse-stabil sein. Dann wäre er in der Lage die ubiquitär vorkommende 5aR1 zu hemmen. Nach Erreichen des Target-Organs, der Prostata, musste der Ester gut in die Zellen aufgenommen werden, um dann von Enzymen der Prostata hydrolysiert zu werden und intrazellulär die korrespondierende Carbonsäure als aktiven Metaboliten freizusetzen. Diese wiederum sollte als potenter und selektiver 5aR2 Inhibitor wirken. Neben guten Hemmwerten der Säuren für die 5aR2 und der Ester für die 5aR1 mussten letztere also noch zusätzlich ein gutes Verhältnis zwischen hydrolytischer Stabilität und Labilität aufweisen.
Zahlreiche Voraussetzungen müssen also erfüllt sein, damit Substanzen als sogenannte Hybridhemmstoffe wirken können. Deshalb wurde eine komplexe in vitro Teststrategie aufgestellt. Um gut vergleichbare Hemmwerte für die 5aR Isoenzyme zu erhalten, wurden ausgehend von den in unserem Arbeitskreis etablierten Zelllinien HEK-I und HEK-II zwei zellfreie Assays entwickelt. Die HEK-I und HEK-II. Wenn nun die Carbonsäure gute Hemmwerte im HEK-II zellfreien Assay zeigte und der korrespondierende Ester ein potenter 5aR1 Inhibitor war, wurden anschließend Stabilitätsuntersuchungen durchgeführt. Dabei musste der Ester zunächst eine ausreichende Hydrolyse-Stabilität in Puffer aufweisen. In Caco-2 Zellhomogenat, das als Modell für den GIT diente, sollte der Ester ebenfalls stabil sein. Die Distribution eines Stoffes erfolgt vor allem über den Blutkreislauf, weshalb auch die Stabilität des Esters in humanem Plasma beobachtet wurde. In BPH-Gewebehomogenat hingegen sollte der Ester von Hydrolasen der Prostata in die 5aR2 aktive Säure gespalten werden. Um schließlich noch die Zellgängigkeit der Ester, die ursprünglich als Prodrugs entwickelt wurden, zu untersuchen, wurde ein Permeationsassay mit den humanen Prostatakarzinom-Zellen DU145 als Modell für die Target-Zellen entwickelt.
Mit Hilfe der beschriebenen Teststrategie wurden potenten und nicht-steroidalen Hybridhemmstoffe der 5aR1 und 5aR2 entdeckt und es konnte ein völlig neuartiges Konzept zur dualen Hemmung beider 5aR Isoenzyme entwickelt werden. Nach Verabreichung eines zellpermeablen Esters, der hydrolytisch stabil gegenüber intestinalen und Plasma-Esterasen ist, kann dieser selektiv die ubiquitär vorkommende 5aR1 hemmen. Im Target-Organ angekommen, wird er von Hydrolasen der Prostata gespalten und kann so intrazellulär die korrespondierende Carbonsäure als potenten 5aR2 Inhibitor freisetzen.
Elevated DHT levels correlate with the pathogenesis and progression of androgen-dependent diseases such as prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH). The irreversible reduction of T to DHT represents the final step in androgen biosynthesis and is catalysed by two isoenzymes, 5-alpha-reductase 1 (5aR1) and 5-alpha-reductase2 (5aR2). Therefore 5aR inhibitors were successfully used to treat BPH. Currently, the therapeutic efficacy of 5aR inhibitors for the prevention of prostate cancer or for treating PCa in combination with antiandrogens should be proved in several clinical studies.In general, the inhibition of both isoenzymes showed to be more advantageous. On the pharmaceutical market, only 2 steroidal 5aR inhibitors are available, Finasteride and Dutasteride, whereas mere the latter is capable to act as dual inhibitor. Due to undesirable side effects of these inhibitors that are believed to be caused by its steroidal structure, non steroidal compounds were synthesised within our working group exhibiting potential dual inhibition.
Potent, non steroidal 5aR2 inhibitors ((4-[1-(2,2-Dicyclohexyl-acetyl)-piperidine-4-ylidenemethyl]-benzoic acids, compounds 1-3) were tested for selectivity against 5aR1. As a test system, we used DU145 cells (human prostatic carcinoma cells expressing 5aR1). Here the human type 2 inhibitors showed poor inhibitory activities. However, these compounds exhibited little permeation in DU145 cells probably because of the deprotonated carboxylic acid moiety at physiological pH. To overcome this limitation a concept was developed to use the corresponding methyl esters (1a-3a) as cell permeable prodrugs.
In order to avoid such permeation influences in our 5aR1 test system, a cell free assay method using DU145 was developed. Interestingly enough, methyl esters themselves displayed inhibitory activities against 5aR1. Esters were not only prodrugs for the corresponding carboxylic acids, but in addition inhibitors toward 5aR1.
Starting with this special kind of dual inhibition of both 5aR isoenzymes, a new hybrid inhibitor concept was developed. The methyl ester serving as precursor for the corresponding acid and at the same time being a selective 5aR1 inhibitor should be stable against hydrolytic enzymes during absorption and distribution in human body. Thus, the compound should be able to inhibit the ubiquitous isoenzyme 1. After reaching the target organ, the prostate, the methyl ester should easily permeate the cells to be hydrolysed by prostatic enzymes and to release the corresponding carboxylic acid as active metabolite intracellular. The acid again could act as potent and selective 5aR2 inhibitor. Besides good inhibitory activities of carboxylic acids toward 5aR2 and of esters toward 5aR1, the latter had to show additionally a good ratio of hydrolytic stability and instability.
Several conditions must be fulfilled that compounds could act as hybrid inhibitors. Within the scope of the development of new inhibitors a complex in vitro test strategy was established. To obtain well comparable inhibition data for both isoenzymes and in addition a high throughput of compounds, two cell-free assays were developed using HEK-I and HEK-II cells transfected with either human 5aR1 or 5aR2. Assays were optimised with respect to substrate concentration, incubation time and protein content. If the carboxylic acid showed good inhibitory activities in the HEK-II cell-free assay and the corresponding ester was a potent 5aR1 inhibitor, stability tests were performed in several biological media. First, esters had to be stable in buffer pH 7.4. In Caco-2 cell homogenate serving as model for the gastro-intestinal tract, the ester should also show adequate hydrolytic stability. Distribution of drugs is particularly due to blood circulation. Therefore ester stability was monitored in human plasma. However in BPH tissue homogenate, prostatic enzymes should cleave the ester into the corresponding acid being able to selectively inhibit 5aR2. Finally, a cell permeation assay was developed to determine the absorption in target cells. Human prostatic carcinoma cell line DU145 was used as a model for the target cells.
By means of this evolved test strategy, potent non steroidal hybrid inhibitors of 5aR1 and 5aR2 could be developed as well as a completely new concept for dual inhibition of 5aR isoenzymes. Application of a cell permeable ester that is hydrolytic stable against intestinal and plasma esterases will lead to a selective inhibition of 5aR1. After reaching the target organ, the ester will be hydrolysed by prostatic enzymes and will yield intracellular the corresponding carboxylic acid that will act as selective and potent 5aR2 inhibitor.
2007-03-19
2017-07-12T07:25:32Z
2007-03-19
2006
2007-03-19
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-10733
hdl:20.500.11880/22420
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22364
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224232019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Design, Synthese und biologische Evaluierung von nichtsteroidalen, potenten und selektiven Inhibitoren der 17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1 (17beta-HSD1)
Design, synthesis and biological evaluation of nonsteroidal, potent and selectiv inhibitors of 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase Type 1 (17beta-HSD1)
Ziegler, Erika
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Hydroxysteroid-Dehydrogenasen
Endometriose
Brustkrebs
17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase
nichtsteroidale Inhibitoren
17beta hydroxysteroid dehydrogenase
nonsteroidal inhibitors
Das Enzym 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1 (17β-HSD1) katalysiert den letzten Schritt der Estrogenbiosynthese, die NADPH abhängige Reduktion des schwach wirksamen Estrons zu dem potentesten Estrogen, Estradiol. Estrogene, insbesondere Estradiol, sind an der Entstehung und Proliferation von estrogenabhängigen Erkrankungen wie z.B. Endometriose und Brustkrebs beteiligt. Daher eignet sich 17β-HSD1 als neues Traget in der Therapie solcher Krankheiten. 17β-HSD Typ 2 katalysiert die Reaktion von Estradiol zu Estron und sollte daher durch Inhibitoren der 17β-HSD1 möglichst nicht gehemmt werden. Ein Agonismus am Estrogenrezeptor sollte ebenfalls vermieden werden. Ausgehend von der für das humane Enzym vorliegenden Kristallstruktur und darauf basierenden Molecular Modelling Versuchen wurde ein Grundgerüst entwickelt, ein phenylsubstituierter Bizyklus, der in verschiedenen Positionen substituiert wurde. Die Substitution führte zur Identifizierung von zwei Positionen, die das Einführen von Resten ohne Verlust der Aktivität und Selektivität erlauben. In der Position 1 des 6-Phenylnaphthalene Templates wurde schliesslich eine große Zahl an Substituenten eingeführt, die zu neuen, hoch aktiven und selektiven Inhibitoren der 17β-HSD1 führte. Einige dieser Verbindungen wurden weiteren verschiedenen in vitro Tests unterzogen. Sie zeigten eine hohe metabolische Stabilität an Ratenlebermikrosomen und eine mittlere bis hohe Permeabilität im Caco-2 Assay. Zwei Inhibitoren wurden auch in vivo getestete und wiesen eine schnelle Absorption und eine gute Halbwertszeit von 1.5h auf.
Human 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (17β-HSD1) catalyzes the NADPH dependent reduction of the weak estrogen estrone into the more potent estradiol, the last step in the formation of estrogens. Estrogens, especially estradiol, have been shown to stimulate the proliferation of hormone dependent diseases. Thus, 17β-HSD1 is an attractive drug target for estrogen dependent diseases such as breast cancer and endometriosis. The type 2 enzyme (17β-HSD2) catalyzes the reverse reaction and should therefore not be affected. Further more estrogen receptor agonism must be avoided. Structure based drug design using the crystal structure of human 17β-HSD1 led to the discovery of novel, selective and potent inhibitors. A scaffold consisting of a phenyl substituted bicyclic moiety was explored as a simplified version of the steroidal substrate, which was substituted at different positions. The substitution led to the identification of two positions which allow the introduction of substituents without loss in activity. Different substituents were introduced in position 1 of the 6-phenylnaphthalene template leading to a large number of active and selective compounds being stable against rat liver microsomes and medium to high permeable as shown in a Caco-2 assay. Two compounds were tested in vivo, too. They showed a fast absorption and a good half life of 1.5h.
2007-04-10
2017-07-12T07:25:33Z
2007-04-10
2007
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-10827
hdl:20.500.11880/22423
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22367
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224292019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Human skin drug delivery using biodegradable PLGA-nanoparticles
Applikation von Wirkstoffen auf humaner Haut mittels bioabbaubarer PLGA-Nanopartikel
Luengo Contreras, Javiana Elizabeth
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Nanopartikel
Biologischer Abbau
Haut
In vitro
Permeation
Penetration
Arzneistoffträger
Humane Haut
pH-Einfluss
CLSM
PLGA
human skin
in vitro
nanoparticle
biodegradation
PLGA
During the last years transdermal drug delivery has gained increasing interest due to the high acceptance of patients. However the major problem of drug delivery via the cutaneous route are the barrier properties of the skin which are located in the stratum corneum. To study the potential of polymeric biodegradable nanocarriers on drug delivery to and through the skin the well known biodegradable copolymer poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA 50:50) was used as main component of the carrier system. As model drug flufenamic acid, an antiinflamatory drug, was incorporated. Nanoparticles in the size range of 200 to 400 nm were prepared by means of a solvent extraction technique. In vitro skin transport experiments using Franz diffusion cell systems and the Saarbrücken model showed an enhancement effect for encapsulated flufenamic acid independent of particle size. Surprisingly, also the presence of drug-free nanoparticles in a preparation (hydrogel) with flufenamic acid in solution has also increased the permeated amount of drug. As mechanism of action an acidic nano-environment around the particles could be identified by confocal laser scanning microscopy and permeation experiments using buffered and non-buffered preparations. Other studies have shown that nanoparticles were able to penetrate into the hair follicles when massage was used. These results underscore the potential of polymeric biodegradable nanoparticles as carriers for transdermal drug delivery. Especially, the acidic pH of the nano-environment of the particles might be an advantage to develop special formulations designed for acidic drugs or might be used to re-establish the physiological acidic pH on the skin surface.
Infolge der hohen Akzeptanz bei Patienten hat die transdermale Applikation von Arzneistoffen mittels Trägersystemen in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Für die kutane Arzneistoffinvasion stellen jedoch die Barriereeigenschaften der Haut, welche im Stratum corneum lokalisiert sind, ein großes Problem dar. Um das Potential polymerer, bioabbaubarer und nano-partikulärer Trägersysteme auf die Arzneistoffinvasion in und durch die Haut zu untersuchen, wurde das schon ausführlich charakterisierte sowie bioabbaubare Copolymer Poly-(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA 50:50) als Trägermaterial eingesetzt. Als Modellarzneistoff wurde Flufenaminsäure, eine antiinflamatorisch wirksame Substanz, in die Nanopartikel inkoorperiert. Unter Verwendung der "Lösungsmittel Extraktions Technik" wurden Partikel im Größenbereich von 200 bis 400 nm hergestellt. Durch in vitro Experimente mit Franz-Diffusionszellen und dem Saarbruecker-Penetrationsmodell konnte gezeigt werden, dass, unabhängig von der Partikelgröße, der Arzneistofftransport verkapselter Flufenaminsäure in bzw. durch die Haut erhöht war. Überraschender Weise konnte bei Zugabe arzneistofffreier Nanopartikel in eine Zubereitung (Hydro-Gel) welche Flufenaminsäure in gelöster Form enthielt ebenfalls eine erhöhte Arzneistoffpermeation beobachtet werden. Mittels Konfokaler Mikroskopie und Permeationsexperimenten wurde als Wirkungsmechanismus, sowohl für gepufferte als auch für ungepufferte Präparationen, ein saurer pH-Wert im Nanometerbereich um die Partikel herum nachgewiesen. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß Nanopartikel unter Anwendung einer Massage in Haarfollikel penetrieren. Die Ergebnisse unterstreichen das Potential polymerer, bioabbaubarer Nanopartikel als Trägersysteme für die transdermale Anwendung. Insbesondere der saure pH-Wert im Nanometerbereich um die Partikel könnte Vorteile für die Entwicklung spezieller Formulierungen für saure Arzneistoffe bieten. Weiterhin wäre auch eine mögliche Applikation zur Wiederherstellung des physiologischen, leicht sauren pH-Wertes der Hautoberfläche im Fall pathophysiologischer Veränderungen denkbar.
2007-05-07
2017-07-12T07:25:35Z
2007-05-07
2007
2007-05-07
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-11189
hdl:20.500.11880/22429
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22373
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224302019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
The potential of nanoscale carriers for drug delivery to intestinal mucosa and skin
Das Potential nanoskaliger Carrier für den Arzneistofftransport in die intestinale Mukosa und in die Haut
Weiß, Barbara
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Nanopartikel
Fluoreszenzmarkierung
Biotin
Haut
Darmschleimhaut
In vitro
In vivo
Oberflächenmodifikation
PLGA
Arzneistofftransport
surface modification
PLGA
in vitro
in vivo
Subjects of the present thesis were the formulation and evaluation of poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) based nanoparticles (NP) addressing the biological barriers intestine and skin. As first step, fluorescence labelled PLGA NP were developed and characterized to study and to visualise interactions with such anatomical sites. Stable fluorescence labelling was accomplished by a covalent polymer modification with a fluoresceinamine. The potential of these NP to investigate penetration and storage in hair follicles in vitro and in vivo was examined within the scope of this work. Moreover, they were evaluated to represent powerful tools to study accumulation and retention in inflamed intestinal mucosa in inflammatory bowel diseases in future clinical studies. Then, the fluorescence labelled NP were advanced to dually fluorescence labelled NP by incorporation of Texas Red as fluorescent model drug. Those NP were applied to demonstrate the impact of multiphoton microscopy to simultaneously study penetration and drug release on excised human skin. Employing flufenamic acid as hydrophilic model drug, the influence of nanoencapsulation on drug penetration into skin was studied using PLGA NP as drug carriers. Finally, a technique to surface functionalize preformed PLGA NP was developed. This approach may allow subsequent versatile binding of proteins (targeting moieties, drugs) and dyes for various applications of interest e.g. targeting the intestinal mucosa.
Das Thema der vorliegenden Dissertationsarbeit ist die Formulierung und Evaluierung von Nanopartikeln (NP) aus Polymilchsäure-co-glykolsäure (PLGA), die an der Darmschleimhaut und auf der Haut zum Einsatz kommen sollen. Zunächst wurden fluoreszenz-markierte PLGA NP hergestellt und charakterisiert, um damit Wechselwirkungen mit diesen biologischen Barrieren zu erforschen und zu visualisieren. Zur stabilen Fluoreszenzmarkierung wurde PLGA kovalent mit Fluoreszeinamin modifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential dieser NP aufgezeigt, Transport und Deposition in Haarfollikeln in vitro und in vivo zu untersuchen. Des Weiteren erwiesen dich diese NP als viel versprechend, um künftig eine Anreicherung und eine verlängerte Retention in entzündeter Darmschleimhaut bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Rahmen einer klinischen Studie zu überprüfen.
Die beschriebene NP-Formulierung weiter entwickelt indem zusätzlich der Fluoreszenzfarbstoff Texas Red in die NP inkorporiert wurde, um als Modellarzneistoff zu dienen. Mit Hilfe dieser NP wurde gezeigt, dass es Multiphotonen-Mikroskopie ermöglicht, simultan Penetration und Arzneistofffreisetzung aus NP auf exzidierter Humanhaut zu visualisieren. Des Weiteren wurden PLGA NP dazu eingesetzt, um zu untersuchen, welchen Einfluss eine Verkapselung des lipophilen Modellarzneistoffs Flufenaminsäure auf den Arzneistofftransport in die Haut hat.
Letztendlich wurde eine Technik entwickelt, mit Hilfe derer die Oberfläche von PLGA NP nach ihrer Formierung modifiziert werden kann. Dadurch können vielseitig Proteine wie "Targeting"-Komponenten oder Proteinarzneistoffe und Fluoreszenzfarbstoffe an NP gebunden werden.
2007-05-08
2017-07-12T07:25:35Z
2007-05-08
2007
2007-06-15
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-11161
hdl:20.500.11880/22430
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22374
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224352019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Arzneistoffentwicklung : Screening-Methoden zur Evaluierung pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Parameter
Drug development : screening methods for the evaluation of pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of compounds
Scherer, Christiane Beatrice Anna
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Bioverfügbarkeit
Arzneimittel
Prostatakrebs
Brustkrebs
Herzinsuffizienz
In vitro
In vivo
präklinische Screenings
perorale Bioverfügbarkeit
5alfa-Reduktase
CYP11B2 (Aldosteronsynthase)
17beta-Hydroxysteroiddehydrogenase 1
preclinical screenings
peroral bioavailability
5alfa-Reductase
CYP11B2 (aldosterone synthase)
17beta-Hydroxysteroiddehydrogenase 1
Das Thema der Dissertation war die Arzneistoffentwicklung und zwar im Bereich von präklinischen Screenings, v.a. zur Untersuchung der peroralen Bioverfügbarkeit. Dazu wurden verschiedene in vitro- und in vivo-Modelle etabliert bzw. angewendet. In vitro wurde hauptsächlich das Caco-2 Modell eingesetzt, erste in vivo-Studien erfolgten anhand von Ratten. Die Forschungsgebiete, in denen die Screenings durchgeführt wurden waren 5alfa-Reduktase, CYP11B2 (Aldosteronsynthase) und 17beta-Hydroxysteroiddehydrogenase 1. Deren Ziel war die Entwicklung von Therapeutika für Benigne Prostatahyperplasie bzw. Prostatakarzinom, Herzinsuffizienz bzw. Myokardfibrose, oder estrogenabhängige Erkrankungen wie z.B. Mammakarzinome oder Endometriose.
In allen Gebieten konnten verschiedene, viel versprechende Verbindungen gefunden werden, die nach weiterer Optimierung potentielle Kandidaten für klinische Studien sein könnten.
The topic of the PhD-thesis was preclinical drug development focussed on peroral bioavailability. Therefore different in vitro- and in vivo- models were established or used during the work. The main in vitro- model were Caco-2 cells, first in vivo-screenings were performed in the rat model. The different research fields, in which the screenings were applied, were 5alfa-Reductase, CYP11B2 (aldosterone synthase), 17beta-Hydroxysteroiddehydrogenase 1. The aim of the studies was to develop drugs for the therapy of benign prostatic hyperplasia or prostate carcinoma, heart failure or myocardial fibrosis, or estrogen-dependant diseases as mamma carcinoma or endometriosis.
After further optimisations, different potential candidates for clinical trials will probably be found in all of the research fields.
2007-05-22
2017-07-12T07:25:37Z
2007-05-22
2006
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-11302
hdl:20.500.11880/22435
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22379
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224362019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Grain size effects on the mechanical behaviour of polycrystalline nickel from micro to nanoscale
Korngrößeneffekte auf das mechanische Verhalten von polykristallinem Nickel von der Micro- zur Nanoskala
Yang, Bo
Vehoff, Horst
ddc:500
Korngröße
Nickel
Nanostrukturiertes Material
Mechanische Eigenschaft
Polykristall
Korngrößeneffekte
nanokristallin
ultrafeinkörnig
Nanoindentierung
Mechanisches Verhalten
grainsize effects
nanocristalline
ultrafine-grain
Nickel
Nanoindentation
mechanical behaviour
In this work the grain size effects on the mechanical behaviour of polycrstalline nickel from micro to nanoscale were studied. Pulse-electrodeposited nanocrystalline nickel was heat-treated to produce different grain sizes. The interaction between dislocations nucleated under the indenter tip and individual grain boundaries was examined by performing nanoindents always in the center of the largest grains in a given metallographic section with a nanoindenting atomic force microscope. The results show that hardness not only depends on the grain size, but also on the ratio of the indent size to the grain size. With increasing indentation depth, hardness increases
or decreases, depending on the relationship between the grain size and the plastic zone size. Direct dislocation-boundary-interaction was observed in the grain size range of 300 nm to 900 nm, where the pop-in width increases with increasing grain size. Later pop-ins occur at lower loads with increasing pop-in widths and could be regarded as the sign of activation of new dislocation sources in the adjacent grains. The result is in agreement with the theoretical
prediction of the classical Hall-Petch model. Strain rate-controlled tensile and nanoindentation experiments are performed to reveal the grain size effects on deformation mechanisms. Results show that with decreasing grain size, the strain rate sensitivity increases and the activation volume decreases. Quantitative analyses of the activation volume show different dislocation sources in coarse-grained nickel and nanocrystalline nickel. Room temperature creep behaviour was observed in nanocrystalline nickel. Insitu bending experiments on bulk nanonickel in an atomic force microscope, for the first time, show that grain boundary sliding at room temperature plays an important role during bending and fatigue tests, and the fatigue crack is intergranular. These results demonstrated that in nanocrystalline nickel the grain boundary mediated deformation processes play a significant role.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der Korngröße auf das mechanische Verhalten von polykristallinem Nickel von der Mikro- zur Nanoskala untersucht. Die unterschiedlichen Korngrößen wurden durch Wärmebehandlung von nanokristallinem Nickel, das über Elektrochemische Impulabscheidung hergestellt wurde, eingestellt. Mit dem nanoindentierenden Rasterkraftmikroskop wurden Versetzungen unter der Indenterspitze nukleiert und derenWechselwirkungen mit Korngrenzen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Nanohärte nicht nur von der Korngröße abhängt, sondern auch von dem Verhältnis der Größe des Nanohärteeindrucks zur Korngröße. Mit zunehmender Eindringtiefe des Indenters steigt oder fällt die gemessene Härte in Abhängigkeit von der Beziehung der Korngröße zur Größe der resultierenden plastischen Zone. Im Korngrößenbereich von 300 nm bis 900 nm wurde eine direkte Wechselwirkung zwischen Versetzungen und Korngrenzen beobachtet. Dabei steigt die Popin-Tiefe mit wachsender Korngröße. Die Pop-ins höherer Ordnung erscheinen hier bei immer niedrigeren Lasten und mit wachsenden Pop-in-Tiefen. Sie können als Zeichen für die Aktivierung von neuen Versetzungsquellen in den direkt benachbarten Körnern angesehen werden. Die Ergebnisse in diesem Bereich stimmen mit den theoretischen Vorhersagen des klassischen Hall-Petch- Modells überein. Um Einflüsse der Korngröße auf das Umformverhalten festzustellen wurden zusätzlich zu dehnratenkontrollierten Nanoindentierungsversuchen makroskopische Dehnratenwechselversuche unter zügiger Beanspruchung durchgeführt. Für kleiner werdende Korngrößen steigen die Dehnratenempfindlichkeiten und die Aktivierungsvolumina fallen. Quantitative Analysen des Aktivierungsvolumens
zeigen jeweils unterschiedliche Versetzungsquellen für grobkörniges und
nanokristallines Nickel. Weitere Untersuchungen beziehen sich auf das Kriechverhalten von nanokristallinem Nickel bei Raumtemperatur. Durch In-situ-Biegeversuche an massivem Nanonickel konnte im Rasterkraftmikroskop zum ersten Mal gezeigt werden, dass Korngrenzengleiten bei Raumtemperatur eine wichtige Rolle während der Biege- und Ermüdungsversuche spielt. Der beobachtete Ermüdungsriss verläuft intergranular. Alle diese Ergebnisse zeigen die herausragende Bedeutung von Korngrenzenmechanismen bei der Verformung von nanokristallinem Nickel auf.
2007-05-30
2017-07-12T07:25:37Z
2007-05-30
2006
2010-05-20
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-11333
hdl:20.500.11880/22436
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22380
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224422019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Biosynthesis and regulation of production of the antibiotic Myxovirescin A in Myxococcus xanthus DK1622
Zur Biosynthese und Regulation des Antibiotikums Myxovirescin A in Myxococcus xanthus DK1622
Simunovic, Vesna
Müller, Rolf
ddc:500
Myxovirescine
Myxococcus xanthus
Biosynthese
Antibiotikum
Polyketide
Sekundärmetabolit
Myxobakterien
Methylation
Nonribosomal-Peptide
Myxococcus xanthus
myxobacteria
antibiotic
biosynthesis
polyketide
nonribosomal peptide
secondary metabolite
Myxobacteria produce a variety of secondary metabolites displaying important biological activities. Recent sequencing of the Myxococcus xanthus DK1622 genome revealed its high potential for the production of secondary metabolites and led to the identification of the myxovirescin biosynthetic gene cluster. In silico analysis of myxovirescin megasynthetase resulted in the proposal that a number of discrete enzymes work together with the multimodular PKS to build myxovirescin scaffold, unique for the presence of two different beta-alkyl groups. To test the myxovirescin biosynthetic model, fourteen in-frame deletion mutants in the myxovirescin biosynthetic gene cluster were created, and their effects on the production of myxovirescin antibiotics evaluated by HPLC-MS analysis of the resulting mutant extracts. Novel myxovirescin analogues arising from certain mutant backgrounds were structurally elucidated to identify the specific positions of these modifications. In silico analysis of an additional 11 kb region encoded upstream from the myxovirescin gene clusters were proposed to be involved in the regulation of its production. Genetic disruption of a gene encoding for a serine/threonine kinase, and two additional genes encoding for proteins of unknown functions, were shown to positively regulate myxovirescin production.
Myxobakterien haben sich in den letzten drei Jahrzehnten als vielseitige Produzenten unterschiedlichster Sekundärmetaboliten (SM) mit zum Teil starker biologischer Wirkung erwiesen. Unter diesen Bakterien sind diverse Multiproduzenten bekannt, zu denen auch das Bakterium Myxococcus xanthus DK1622 zählt. Die erst vor kurzem abgeschlossene Sequenzierung des Gesamtgenoms von Myxococcus xanthus DK1622 zeigt das enorme Potential für die Produktion verschiedenster SMs. Auf diesem Weg konnte ebenfalls das Myxoverescin-Biosynthesegencluster identifiziert werden. Die annotierte Genomsequenz lieferte erste Möglichkeiten für eine in silico Analyse der Myxovirescin Megasynthase und führte zum Postulat eines möglichen Biosynthesewegs. In diesem bildet eine multimodulare PKS das Myxovirescin-Grundgerüst, welches nachträglich durch verschiedene separate Enzyme modifiziert wird. Diese Enzyme katalysieren den Einbau zweier ungewöhnlicher beta-Alkylgruppen. Um die Beteiligung des identifizierten Genclusters an der Myxovirescin-Biosynthese zu beweisen, wurden vierzehn "in-frame" Deletionsmutanten erzeugt. Die Auswirkung der jeweiligen Mutation auf die Produktion des Antibiotikums wurde mittels HPLC/MS Analyse der erhaltenen Kulturextrakte untersucht. Um in den neuen Myxovirescin-Derivaten die spezifische Veränderung innerhalb des Moleküls zu identifizieren, wurde deren Struktur aufgeklärt. Stromaufwärts des Biosynthesegenclusters konnte eine ca. 11 kb große genomische Region identifiziert werden, in der Gene kodiert sind, die möglicherweise regulatorische Auswirkungen auf die Myxovirescin-Produktion haben. Durch Geninaktivierungen, sowohl eines Serin/Threonin Kinase kodierenden Gens, als auch zweier Gene mit unbekannter Funktion, konnte eindeutig gezeigt werden, dass die jeweiligen Enzyme an der Produktionsregulation beteiligt sind.
2007-07-06
2017-07-12T07:25:39Z
2007-07-06
2007
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-11864
hdl:20.500.11880/22442
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22386
eng
openAccess
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224442019-01-10T07:43:19Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Electrocrystallization and characterization of nanostructured gold and gold alloys
Elektrokristallisation und Charakterisierung von nanostrukturiertem Gold und Goldlegierungen
Yevtushenko, Oleksandra
Hempelmann, Rolf
ddc:500
Elektrokristallisation
Kinetik
Nanostruktur
Keimbildung
Gold
Goldlegierung
electrocrystallization
nucleation
nanostructure
crystallite growth
gold
gold alloys
The kinetics of electrocrystallization of nanostructured gold is investigated and the physical proper-ties of nanostructured materials such as thermal stability, surface roughness and hardness are improved. A new stable non-toxic electrolyte for the electrodeposition of gold and gold alloys is presented. Nanoscaling is achieved by pulse techniques. The possibility of controlling the crystallite size depending on physical and chemical process parameters such as pulse duration, current density, bath temperature, type and amount of additives is shown. A new general equation for the current transient for three-dimensional nucleation and mixed ion transfer and diffusion controlled growth with previous adsorption process based on the existing theories is reported. The theoretical predictions of this equation and its relevance for the analysis of current-time transients are discussed and compared with experimental observations. The characterizations are made by means of in situ high-temperature X-ray diffraction, scanning electron microscopy, atomic force microscopy and microindentation.
Die Kinetik der Elektrokristallisation von nanostrukturiertem Gold wird untersucht und die physikalischen Eigenschaften von Gold und Goldlegierungen wie thermische Stabilität, Oberflächenrauhigkeit und Härte verbessert. Ein neuer, stabiler, nicht toxischer Elektrolyt für die Abscheidung von Gold und Goldlegierungen wird vorgestellt. Nanoskalierung wird durch gepulste Elektrolyse erreicht. Es wird gezeigt, dass es möglich ist, die Größe der Kristallite abhängig von physikalischen und chemischen Herstellungsparametern wie Pulsdauer, Stromdichte, Temperatur des Elektrolyten, Art und Menge der Additive zu kontrollieren. Eine neue allgemeingültige Gleichung, basierend auf bereits bekannten Theorien, die den zeitlichen Stromverlauf für dreidimensionale Keimbildung und gemischten Ladungstransfer bzw. diffusionskontrolliertes Wachstum mit vorherigem Adsorptionsprozess beschreibt, wird entwickelt. Die theoretischen Vorhersagen dieser Gleichung und ihre Anwendbarkeit zur Analyse von Strom-Zeit-Kurven werden diskutiert und mit experimentellen Beobachtungen verglichen. Zur Charakterisierung werden verschiedene Techniken wie in situ-Hochtemperatur-Röntgendiffraktometrie, Rasterelektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und Mikroindentation angewendet.
2007-07-25
2017-07-12T07:25:40Z
2007-07-25
2007
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-12370
hdl:20.500.11880/22444
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22388
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224452019-01-10T07:43:19Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Polyketidbiosynthese in Myxobakterien
Polyketide Biosynthesis in Myxobakteria
Frank, Bettina
Müller, Rolf
ddc:500
Biosynthese
Polyketide
Myxobakterien
Naturstoff
natural products
biosynthesis
polyketides
myxobacteria
Zu den wenigen von Myxobakterien produzierten biologisch aktiven reinen Polyketiden gehören Aurafuron und Spirangien. Beide weisen ungewöhnliche funktionale Gruppen auf: Aurafuron eine Furanon- und Spirangien eine Spiroketalstruktur. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biosynthese dieser Verbindungen durch Typ I Polyketidsynthasen (PKS) in S. aurantiaca DW4/3-1 bzw. S. cellulosum So ce90 untersucht. Das Spirangien-Biosynthesegenclusters war zu Beginn der Arbeit nur zur Hälfte bekannt, die unbekannte Sequenz wurde nach Hybridisierung einer generierten genomischen Bibliothek mit einer spezifischen Sonde identifiziert und sequenziert. Beide Biosynthesegencluster wurden sowohl durch in silico Analysen, als auch durch zielgerichtete Mutagenesen einzelner Biosynthesegene funktional charakterisiert.
Die Aurafuron-Biosynthese in S. aurantiaca DW4/3-1 folgt nicht dem Kolinearitätsprinzip und schließt höchstwahrscheinlich die bisher selten beschriebene iterative Nutzung eines PKS-Modules ein. An der Post-PKS Biosynthese sind vier Oxidoreduktasen beteiligt, von denen eine möglicherweise eine Baeyer-Villiger Oxygenase darstellt. Mindestens zwei zusätzliche Aurafuron-Derivate wurden identifiziert. Der Vergleich der Biosynthesegene mit denjenigen von Aurafuron-ähnlichen Verbindungen aus Streptomyces sp. weist darauf hin, dass sich die Biosynthesewege größtenteils unabhängig voneinander entwickelt haben.
Die Spirangien-Biosynthese in S. cellulosum So ce90 folgt weitestgehend dem Kolinearitätsprinzip. Durch die Inaktivierung zweier Methyltransferasen wurde eine Reihe neuer Desmethylderivate generiert und nachfolgend strukturell charakterisiert. Die Ergebnisse der Inaktivierungen der Cytochrom P450 Monooxygenasen zeigen, dass diese Enzyme an der Bildung der Spiroketalfunktion beteiligt sind. Das Vorhandensein mehrerer größerer Sequenzwiederholungen im Biosynthesegencluster lässt darauf schliessen, dass während der evulotionären Entstehung des Genclusters mindestens drei Duplikationsereignisse stattgefunden haben. Im Laufe der Arbeit wurde eine Mutante identifiziert, welche verkürzte Spirangienderivate produziert. Die Ergebnisse der phänotypischen und genotypischen Charakterisierung dieser Mutante deuten darauf hin, dass eine spontane Mutation im Biosynthesegencluster die Produktion der neuen Derivate verursacht hat.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zudem mögliche regulatorische Proteine der Sekundärstoffproduktion in S. cellulosum So ce90 identifiziert und charakterisiert. Anhand der Ähnlichkeit zum Regulator der Chivosazolproduktion ChiR im sequenzierten Modellstamm S. cellulosum So ce56 konnte ein Gen (deoRA) identifiziert und sequenziert werden, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert. Die Inaktivierung von deoRA führte zum Verlust der Spirangienproduktion und zur deutlichen Minderung der Epothilonproduktion. Die Einbringung zweier alternativer Promotoren vor deoRA führte nicht zu einer Produktionssteigerung von Spirangien oder Epothilon. Daraus ist zu schliessen, dass DeoRA für die Produktion nicht limitierend ist. Eine Bindung von DeoRA an die Spirangien- und Epothilon-Promotorregion konnte nach heterologer Expression des Proteins in vitro nicht nachgewiesen werden. DeoRA beeinflusst die Transkription der Biosynthesegene mit hoher Wahrscheinlichkeit indirekt.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten Kenntnisse über den Ablauf und die Evolution der Aurafuron- und Spirangien-Biosynthese gewonnen werden. Zielgerichtete Mutagenesen führten zur Produktion neuer Naturstoffderivate. Die erstmalige Identifizierung eines Regulators der Sekundärstoffproduktion in S. cellulosum So ce90 ermöglicht weitere Untersuchungen zur Regulation der Sekundärstoffproduktion in dem Epothilon-Produzenten.
Only few of the biologically active compounds produced by myxobacteria are pure polyketides. Among these, aurafuron and spirangien display interesting functional groups: aurafuron a contains a furanone moiety and spirangien exhibits a spiroketal function. In this study, the biosynthesis of these compounds in S. aurantica DW4/3-1 and S. cellulosum So ce90 by type I polyketide synthases (PKSs) was investigated. The sequence of the spirangien biosynthetic gene locus was identified by screening of a genomic library with a specific probe and sequenced. The biosynthetic gene clusters were characterized by both, in silico analyses and the analysis of targeted gene inactivation experiments.
Aurafuron biosynthesis in S. aurantica DW4/3-1 does not follow the canonical colinearity rule and most likely includes the iterative usage of a module, a feature that has only been rarely reported for type I PKS. Four oxidoreductases are involved in post-PKS biosynthesis, one of them is presumably acting as a Baeyer-Villiger monooxygenase. At least two so far unknown derivatives were identified. The comparison of the biosynthetic genes with such responsible for the formation of very similar compounds from Streptomyces sp. suggests that the biosynthetic pathways developed independently of each other.
The biosynthesis of spirangien in S. cellulosum So ce90 is almost following the colinearity paradigm. The targeted inactivation of two methyltransferase encoding genes led to the production of novel desmethylderivatives that were subsequently structurally characterized. The results of inactivation experiments of cytochrome P450 monooxygenase encoding genes indicate that these enzymes are involved in the formation of the spiroketal moiety. The presence of large stretches of sequence repeats points to at least three duplication events which took place during the evolution of the biosynthetic gene locus. A mutant was identified that produces truncated spirangien derivatives. The phenotype and the genotype of the mutant were analyzed suggesting that a spontaneous mutation in the biosynthetic gene locus led to the production of the new derivatives.
Within this study proteins with a putative regulatory function in S. cellulosum So ce90 secondary metabolism were identified and characterized. Taking advantage of the homology to the ChiR regulator of chivosazol biosynthesis in the sequenced model strain S. cellulosum So ce56, a transcription factor encoding gene (deoRA) was identified and sequenced. The inactivation of deoRA led to the abolishment of spirangien production and to a dramatic decrease in epothilon formation. The introduction of two alternative promoters upstream of deoRA did not enhance production levels of spirangien and epothilon. Thus DeoRA does not seem not to be limiting for the production of these metabolites. After heterologous expression of DeoRA, no binding to the spirangien and epothilon promoter regions could be observed in vitro, suggesting that DeoRA is not directly regulating transcription of the biosynthetic genes.
During this study insight was gained into the molecular basis and the evolution of aurafuron and spirangien biosynthesis. Targeted gene manipulation led to the production of novel derivatives of these natural products. For the first time a regulatory protein of secondary metabolite production in S. cellulosum So ce90 could be identified. This enables further studies on the regulation of secondary metabolite formation in the epothilon producer.
2007-07-26
2017-07-12T07:25:40Z
2007-07-26
2007
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-12415
hdl:20.500.11880/22445
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22389
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/224572019-01-10T07:43:18Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Pulmonary epithelial cells as model to investigate in vivo drug absorption across the human air-blood barrier
Pulmonale epitheliale Zellkulturmodelle zur Untersuchung von in vivo Absorptionsvorgängen an der menschlichen Luft-Blut-Schranke
Bur, Michael
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Zellkultur
Lunge
Permeabilität
Resorption
Arzneimittel
air-interface culture
air-interface deposition
Salbutamol
Budesonid
human alveolar epithelial cells
The lung is more and more of interest for local as well as for systemic administration of drugs. Nevertheless, the development of modern inhalable medicines is moving forward only slowly. Especially the lack of safety and efficacy data combined with unsatisfactory in vitro models for the investigation of the complex processes on the air-blood barrier decelerates the development of new aerosol medicines.
In the first part of this thesis the transport of peptides with different molecular weight across submersed human alveolar epithelial cells has been investigated. The measured absorption/ secretion rates allow quantifying of permeability and the identification of active or passive transports, but the influence of formulation parameters like size or charge disappears after preparing solutions and adding these in the fluid filled apical compartment of submersed cell culture. However, with the aid of a relatively simple insufflator syringe and air interface cultivated cells, a deposition more close to the in vivo situation was possible. It was found that air interface deposition yielded higher absorption rates and that differences in particle size significantly influenced the absorption rates only after air interface deposition but not after liquid interface deposition. Even if the application with the insufflator syringe offers the opportunity to deposit dry particles on the air interface of cell monolayers the method wasn';t able to simulate in vivo relevant impaction processes. Especially in case of dry powder aerosols composed of large carrier lactose particles and adherent micronized drug crystals, impaction processes during aerosolisation normally accomplish separation of the drug from the carrier. Only the sufficiently small (< 5 µm) drug crystals are deposited in the deeper regions of the lung. As the insufflator fails to separate the drug crystals from the carrier lactose, and as the particle size of the carrier particles significantly influences the dissolution and absorption behaviour, a cell compatible aerosol impingement system was designed. A commercial available MSLI was modified to incorporate cell culture inserts in the relevant stages. Complex powder formulations could be size fractionated and the size fractions which are able to reach in vivo the deep lung were deposited on cell monolayers. Significantly changed absorption behaviour could be detected in dependency of cell culture fluid volume, particle size and deposition mode.
Im ersten Teil der Dissertation wurde die Permeation von gelösten Peptiden mit verschiedenem Molekulargewicht durch Monolayer humaner alveolarer Epithelzellen untersucht. Auch wenn das Arbeiten mit Lösungen für die Untersuchung intestinaler Absorptionsvorgänge die in vivo Situation ausreichend genau wiedergibt, stellt diese Methode keine realistische Applikationsart für Aerosole dar, da die menschliche Luft-Blut-Schranke beim gesunden Patienten nur mit einem ausgesprochen dünnen Flüssigkeitsfilm bedeckt ist, der nur den hundertsten Teil der Dicke üblicher Flüssigkeitsschichten in submersen Zellkulturen ausmacht. Realitätsnah lassen sich jedoch Calu-3 Zellen als Modelle des Bronchialepithels, und primäre humane alveolare Epithelzellen als Modell der alveolaren Bereiche der Lunge, ohne flüssigkeitsgefülltes apikales Kompartiment kultivieren.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde mittels solcher an der Luft-Grenzschicht kultivierter zellulärer Modelle untersucht inwiefern die Applikation als Lösung oder in Form eines trockenen Pulveraerosols den Transport von Arzneistoffen beeinflusst. Nach Deposition trockener Aerosolformulierungen auf Luft-Grenzschicht kultivierte Zellen konnten signifikant schnellere Resorptionsvorgänge gemessen werden. Obwohl die angewandte Applikation mittels einer Insufflator Spritze an sich schon eine sinnvolle Verbesserung von Transportexperimenten an Modellen der Luft-Blutschranke darstellt, berücksichtigt die Insufflator Spritze nicht alle Aerosol Charakteristika. Vor allem im Falle von Aerosolen mit Laktose Partikeln als Wirkstoffträger war die Insufflator Spritze nicht in der Lage die Separation der mikronisierten Arzneistoffkristalle von den wesentlich größeren Laktose Trägern zu bewerkstelligen. Um auch diese Prozesse wirklichkeitsnah zu simulieren wurde im dritten Abschnitt der Arbeit ein zellkompatibler Kaskaden-Impaktor entwickelt. In diesem war es möglich sowohl eine realistische Auftrennung der Aerosole nach der Partikelgröße als auch die Deposition der einzelnen Partikelfraktionen auf Luft-Grenzschicht kultivierte Zellmonolayer nachzuahmen.
2007-09-13
2017-07-12T07:25:44Z
2007-09-13
2007
2007-09-13
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-12780
hdl:20.500.11880/22457
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22401
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/225072019-01-10T07:43:19Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Eindimensionale oxidische Nanostrukturen mittels chemischer Gasphasenabscheidung und Synthese heterometallischer Übergangsmetallalkoxide (Co, Mn und Fe)
One-dimensional oxide nanostructures by CVD and synthesis of heterometallic transition metal alkoxides (Co, Mn und Fe)
Barth, Sven
Mathur, Sanjay
ddc:500
MOCVD-Verfahren
Alkoholate
Metalloxide
Zinnoxid
Magnetit
Heterostrukturen
Nanowire
Nanowire
Tin oxide
Magnetite
Heterostructures
Alkoxides
Eindimensionale (1D) anorganische Materialien weisen, abhängig von ihrer Größe, Form und Orientierung, interessante strukturelle Merkmale und Funktionalitäten auf. In der vorliegenden Dissertation wurde ein allgemeiner MOCVD-Prozess zur größen- und orts-selektiven Darstellung von Metalloxid-Nanodrähten (NWs) entwickelt, der auf einer Kombination von Precursordesign und katalysator-unterstütztem Wachstum basiert. Hierbei wurden hochkristalline Zinnoxid-, Eisenoxid- und Indiumoxid-NWs via CVD geeigneter molekularer Vorstufen (Alkoxide) hergestellt, deren axiale und radiale Ausdehnung in einem Bereich von 20-900 nm bzw. 0,5-~100 µm durch Kontrolle der Precursorzufuhr, Abscheidetemperatur und Katalysatorgröße variiert werden konnte. Darüber hinaus wurden hierarchische SnO2 / V2O5 1D-Strukturen durch einen zweistufigen Prozess erhalten.
Das Anwendungspotential dieser 1D-Nanomaterialien als Photo- und Gassensoren wurde anhand von Multi- und Einzeldraht-Bauteilen untersucht. Einzelne SnO2- und Fe3O4-NWs wurden durch FIB-Nanolithographie kontaktiert um durchmesserabhängige Besonderheiten zu untersuchen und um präzise Kenntnisse bezüglich umgebungsabhängiger elektrischer und sensorischer Eigenschaften (SA, N2, H2O, CO) zu erlangen.
Darüber hinaus wurden heterometallische Alkoxide, Spirozyklen und Seco-Norkubane, als potentielle Vorstufen zur Materialsynthese und als Intermediate für Metathesereaktionen zum Aufbau komplexer Moleküle synthetisiert.
One-dimensional (1D) inorganic materials exhibit unique structural features and functional properties, related to their lateral size, shape and orientation. We have developed a generic MOCVD approach for size-selective and site-specific growth of oxide nanowires by combination of chemical precursor design and a catalyst assisted growth mechanism. For instance, high-yield synthesis of NWs of tin, iron and indium oxides was performed by the chemical vapor deposition of appropriate alkoxide precursors. Axial and radial dimensions of the NWs were varied in the ranges 20-900 nm and 0,5-~100 µm by adjusting precursor feedstock, deposition temperature, and catalyst size. Hierarchical tin / vanadium oxide heterostructures were synthesized by a two-step synthesis strategy.
The device potential of these 1D building blocks as photo- and gas sensors was evaluated. Besides multiwire devices, individual SnO2 and Fe3O4 nanowires were contacted by FIB-nanolithography and their diameter dependent intrinsic properties were investigated to obtain precise information of electrical and sensing behaviour in different atmospheres (SA, N2, H2O, CO).
In addition, new heterometallic alkoxide spirocycles and seco-norcubanes as precursors and intermediates for salt elimination reactions containing alkali metals and bivalent transition metals were synthesized and structurally characterized in this thesis.
2008-06-02
2017-07-12T07:26:01Z
2008-06-02
2008
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-15892
hdl:20.500.11880/22507
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22451
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/225422019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Synthesis and evaluation of hepatitis C antivirals : viral E2 glycoprotein / human CD81 receptor interaction inhibitors
Synthese und Evaluierung von Hemmstoffen für die Interaktion des viralen E2 Glykoproteins des Hepatitis C Virus mit dem humanen CD81 Rezeptor
Holzer, Marcel
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Hepatitis-C-Virus
Glykoproteine
Protein-Protein-Wechselwirkung
Inhibitor
Virusrezeptor
CD81-Rezeptor
Protein-Protein-Interaktion
HCV-E2 Glykoprotein
Hepatitis-C-virus
protein protein interaction
HCV-E2 glycoprotein
The aim of the present work was to prepare compounds which inhibit the CD81-LEL—HCV-E2 interaction by binding to CD81-LEL.
Starting point was a virtual screening using the open conformation of the LEL followed by synthesis and biological validation by means of an antibody neutralization assay. This showed benzyl salicylate to be moderately active with an inhibition of 25 % at 50 µM. Furthermore a biological screening revealed terfenadine to be a moderate inhibitor of the CD81-LEL—HCV-E2 interaction (27 % at 50 µM) as well.
These two hits served as lead structures for further syntheses to increase inhibitory potency. Concerning benzyl salicylate 48 compounds with diverse substitution patterns were prepared. The synthesized compounds showed no increased inhibitory potency compared to benzyl salicylate.
For the derivatization of terfenadine 63 compounds with different structural modifications were synthesized. Their biological activity clearly demonstrates that a bulky substitution pattern at both parts of the molecule is necessary for activity as well as an H-bond acceptor at the alkyl linker. The most active compound in this series of derivatives showed an inhibition of 69 % at 50 µM.
Additional experiments with the terfenadine derivatives using viral particles revealed that there might be additional HCV infection reducing mechanisms which remain to be elucidated.
Das Ziel dieser Arbeit war die Darstellung von Verbindungen, die die CD81-LEL—HCV-E2 Interaktion durch Bindung an CD81-LEL verhindern.
Der Ausgangspunkt hierfür war ein virtuelles Screening unter Zuhilfenahme der offenen Konformation der LEL, gefolgt von Synthese und biologischer Validierung mittels eines Antikörper-Neutralisationstests. Hierbei wurde Benzylsalicylat als mäßig aktive Verbindung mit einer Hemmung von 25 % bei 50 µM gefunden. Weiterhin zeigte ein biologisches Screening, daß Terfenadin ebenfalls ein mäßiger Inhibitor (27 % bei 50 µM) der CD81-LEL—HCV-E2 Interaktion ist.
Diese beiden Hits dienten als Leitstrukturen für die weitere Synthese zur Erhöhung der Hemmung. Von Benzylsalicylat wurden 48 Derivate mit verschiedenartigem Substitutionsmuster dargestellt. Die dargestellten Verbindungen zeigten keine gesteigerte Hemmung im Vergleich zu Benzylsalicylat.
Zur Derivatisierung des Terfenadin wurden 63 Verbindungen mit unterschiedlichen strukturellen Modifikationen hergestellt. Die biologische Aktivität dieser Verbindungen zeigte deutlich, daß ein voluminöser Substituent an beiden Seiten des Moleküls, sowie ein Wasserstoffbrückenakzeptor an dem Alkyllinker nötig sind. Die aktivste Verbindung dieser Derivate zeigte eine Hemmung von 69 % bei einer Konzentration von 50 µM.
Ergänzende Experimente mit viralen Partikeln zeigten, daß bei den Terfenadinderivaten weitere, die Infektiosität von HCV reduzierende Mechanismen eine Rolle spielen könnten. Die Aufklärung dieser Mechanismen bedarf weiterer Untersuchungen.
2008-07-23
2017-07-12T07:26:09Z
2008-07-23
2008
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-16452
hdl:20.500.11880/22542
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22486
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/225522019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Analyse von Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen auf neuartigen, magnetisch strukturierten Substraten
Analysis of cell-surface interactions on novel magnetically structured substrates
Loichen, Juliane
Hartmann, Uwe
ddc:500
Nanopartikel
Stammzelle
Zellkultur
Magnetismus
Biokompatibles Substrat
nanoparticle
stem cell research
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein System zu entwickeln, mittels dessen Zellen in kontrollierbarer Weise über Wechselwirkungen mit strukturierten Oberflächen beeinflussbar sind. Das neu entwickelte System beinhaltet den Vorteil der in-vitro-Strukturveränderung durch den Einsatz extern erzeugter Magnetfelder.
Die Vorgehensweise besteht darin, biokompatible Magnetitpartikel der Größenordnung 200nm biologisch zu funktionalisieren und über externe Magnetfelder in Strukturen auf Substraten anzuordnen. Bei Versuchen die Anordnung der Teilchen auf Oberflächen durch rein externe Magnetfelder zu kontrollieren, trat das Problem der Endozytose auf, so dass eine festere Anbindung der Teilchen an das Substrat nötig war.
Yttrium-Eisen-Granatfilme konnten wegen ihrer spezifischen, mittels externer Felder variabler Domänenstruktur als geeignetes Substrat zur Partikelimmobilisierung eingesetzt werden. Die Tatsache, dass die Partikel Änderungen der Domänenkonfiguration folgen, ermöglicht die in-vitro-Strukturveränderung des Substrats. Die Partikel-Oberflächen-Wechselwirkung wurde im Rahmen der Magnetostatik theoretisch behandelt.
Zusätzlich konnten Methoden entwickelt werden, die eine örtlich kontrollierte Deposition der Partikel unterschiedlicher Geometrie im Bereich von 10µm-50µm erlauben. Die Entwicklung einer computergesteuerten Klimakammer mit einer Spulenvorrichtung zur Erzeugung magnetischer Felder erlaubt zudem das dynamische Studieren der Zellen über mehrere Tage hinweg. Unter bestimmten Struktureinflüssen zeigen die Zellen anisotropes Wachstum. Zur Untersuchung dieses speziellen Verhaltens auf unterschiedlichen Strukturen, sowohl auf statischen als auch auf dynamischen, wurden Experimente durchgeführt und im Hinblick auf gezielte Zellkontaktierung ausgewertet. Verschiedene Aspekte der Zelladhäsion werden diskutiert, um das Zellverhalten theoretisch erklären zu können, so dass letztlich Aussagen über Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen, die durch die Substratstruktur bestimmt werden, getroffen werden.
The main goal of the present work was the development of a setup which allows for controled influencing of cells via surface-cell-interaction. The major advantage of the developed system is that structural changes by means of external magnetic fields are possible in vitro.
The principle consists in the biofunctionalization of biocompatible magnetite nanoparticles of a diameter of 200nm and their specific arrangement on substrates under the influence of external fields. The problem of endocytosis occurred in experiments, where the particle arrangement on the substrate was solely controled by an external magnetic field. Thus a stronger immobilization of the particles on the substrate is needed.
The specific and in external magnetic fields highly variable domain structure of magnetic yttrium-iron garnet films allows for appropriate particle immobilization. The immobilized particles follow the changing domains because of their magnetic interaction with the field gradients at the domain walls. This opens the possibility of in vitro structural modifications of the substrate. The particle-surface interaction is treated on a magnetostatic level theoretically.
Additional methods which enable a spatially controlable particle deposition in areas of different geometries in the range of 10µm-50µm which is comparable to the size of cells, were developed. The construction of a computer-controled climate chamber with a coil system for a magnetic environment and a video setup permits insight into the cell behavior over several days. Depending on specific structural influences, the cells show anisotropic growth. Investigations on this particular cell behavior on static as well as on dynamic substrates have been performed and analyzed with respect to controled contacting of cells. Different aspects of cell adhesion are explored for theoretically explaining the cell behavior on diverse substrate structures. Conclusions about cell-surface-interactions caused by the substrate structures are drawn.
2008-09-04
2017-07-12T07:26:12Z
2008-09-04
2008
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-16784
hdl:20.500.11880/22552
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22496
ger
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Alle Ressourcen in diesem Repository sind urheberrechtlich geschützt
oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/225532019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Myxococcus xanthus - a myxobacterial model strain as multiproducer of secondary metabolites
Myxococcus xanthus - myxobakterieller Modellstamm und vielfältiger Naturstoffproduzent
Meiser, Peter
Müller, Rolf
ddc:500
Bakterien
Myxobakterien
Myxococcus xanthus
Sekundärmetabolit
Biotechnologie
bacteria
myxobacteria
secondary metabolites
biotechnology
Within the last three decades, myxobacteria have been established as proficient producers of secondary metabolites that exhibit various biological activities. The recently finished genome sequencing project of Myxococcus xanthus DK1622 unveilled the — at least hypothetical — potential of this myxobacterial model strain to be a multiproducer of secondary metabolites as well. Applying a combined genetic and analytical approach, indeed several natural products and the corresponding biosynthetic gene clusters were identified and analyzed in our institute. Among them, four families of metabolites — myxochelins, myxochromids, myxalamids and myxovirescins — were already known from other myxobacterial species. The DKxanthene secondary metabolite family, however, resembles a novel class of compounds that appears to be unique to myxobacteria, and they were shown to be present in all Myxococcus xanthus strains investigated to date as well as in the closely related species Stigmatella aurantiaca. Studies aiming at the investigation of the biological function of these compounds strongly suggest that they are required for a proper progress of the developmental program that culminates in the formation of fruiting bodies and mature myxospores. DKxanthenes are synthesized by a hybrid polyketide synthase - nonribosomal peptide synthetase machinery, and the detailed analysis of the biosynthetic gene cluster proposes the presence of at least one iteratively acting polyketide synthase module that is in large part responsible for the diversity of metabolites from this family.
Myxobakterien wurden in den letzten drei Jahrzehnten als außergewöhnliche Quelle sogenannter Sekundärmetabolite mit vielseitigen biologischen Wirkungen etabliert. Duch die vollständige Sequenzierung des Genoms von Myxococcus xanthus wurde das — zumindest theoretische — Potenzial dieses myxobakteriellen Modellstammes als Multiproduzent von Sekundärmetaboliten aufgezeigt. Im Rahmen einer kombiniert genetisch-analytischen Vorgehensweise konnten im Rahmen dieser Arbeit tatsächlich einige Naturstoffe und die dazugehörigen Biosynthesegene identifiziert werden. Darunter sind vier Familien von Sekundärstoffen - die Myxocheline, Myxochromide, Myxalamide und die Myxovirescine - die bereits von anderen Myxobakterien bekannt waren. Des Weiteren konnte eine neue Familie von Naturstoffen - die DKxanthene - charakterisiert werden. Diese scheinen spezifisch für Myxobakterien zu sein, da sie in allen bisher analysierten M. xanthus Stämmen und auch in der nahe verwandten Spezies Stigmatella aurantiaca identifiziert werden konnten. DKxanthene spielen eine wichtige Funktion für den Lebenszyklus des Produzenten, da sie für die geregelte Fruchtkörper- und Myxosporenbildung notwendig sind. Die DKxanthen-Biosynthese wird durch einen kombinierten Polyketidsynthase-nichtribosomale Peptidsynthetase Biosyntheseapparat gesteuert. Die detaillierte Analyse des Biosynthese-Genclusters weist hierbei auf die Mehrfachnutzung von mindestens einem Polyketidsynthase-Modul hin; eines von mehreren Besonderheiten, die zu der chemischen Diversität dieser Naturstoffe führt.
2008-09-04
2017-07-12T07:26:13Z
2008-09-04
2008
2008-09-04
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-16834
hdl:20.500.11880/22553
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22497
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226012019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Tackling aldosterone-mediated disorders : lead optimization providing a series of 3-pyridine-based aldosterone synthase inhibitors with improved pharmacological properties
Entwicklung von selektiven Hemmstoffen der Aldosteronsynthase (CYP11B2) als innovative Option zur Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen
Lucas, Simon
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Cytochrom P-450
Inhibitor
Herzinsuffizienz
Aldosteron
Renin-Angiotensin-System
In vitro
In vivo
Wirkstoffdesign
Aldosteronsynthase (CYP 11B2)
nichtsteroidale Hemmstoffe
Aktivität in vitro und in vivo
Selektivität
drug design
aldosterone synthase (CYP11B2)
nonsteroidal inhibitors
activity in vitro and in vivo
selectivity
3-Pyridine substituted naphthalenes constitute a class of potent inhibitors of aldosterone synthase (CYP11B2), an innovative target for the treatment of aldosterone-mediated disorders such as congestive heart failure and myocardial fibrosis. However, these early leads exhibit several major pharmacological drawbacks, above all undesirable hepatic CYP interactions and lacking in vivo activity. In order to overcome these obstacles, a drug design program toward a development candidate was launched following a combined ligand- and structure-based approach. The optimization process yielded 110 new compounds, classified into four main molecular scaffolds, most of which are highly potent CYP11B2 inhibitors with IC50 values in the low nanomolar to picomolar range. Beside a striking selectivity toward the highly homologous 11beta-hydroxylase (CYP11B1), the most promising compounds of the present study show virtually no inhibition of the six most important hepatic CYP enzymes as well as CYP17 and CYP19, both crucial enzymes for the metabolism of steroid hormones. A subset of the investigated inhibitors reaches excellent plasma-levels in the range of the marketed drug fadrozole after peroral application to rats. Furthermore, a derivative of the dihydro-1H-quinolin-2-one series exerts potent aldosterone-lowering effects in vivo using ACTH stimulated rats. In conclusion, the current work might give rise to a development candidate after further optimization and biological testing.
3-Pyridinsubstituierte Naphthalene sind potente Hemmstoffe der Aldosteronsynthase (CYP11B2), einem innovativen Target zur Behandlung von Herzinsuffizienz und Myokardfibrose. Die entwickelten Leitverbindungen weisen jedoch unerwünschte Wechselwirkungen mit hepatischen CYP Enzymen auf und können die Aldosteronbiosynthese in vivo nicht hemmen. In der vorliegenden Arbeit wurden 110 neuartige Hemmstoffe, entwickelt durch Ligand- und Struktur-basiertes Design, synthetisiert und auf biologische Aktivität getestet, um diese Hindernisse auf dem Weg zu einem Entwicklungskandidaten zu überwinden. Die meisten der hierin vorgestellten Verbindungen sind nicht nur hochpotente CYP11B2 Inhibitoren mit IC50-Werten im nano- bis picomolaren Bereich, sondern auch besonders selektiv gegenüber CYP11B1 (11beta-Hydroxylase), einem Enzym mit hoher Homolgie zu dem eigentlichen Target. Außerdem weisen die vielversprechenden Hemmstoffe ein deutlich verbessertes pharmakologisches Gesamtprofil gegenüber den entsprechenden Naphthalenderivaten auf: Keine oder nur geringe Hemmung der sechs wichtigsten hepatischen CYP-Enzyme sowie den steroidmetabolisierenden Enzymen CYP17 und CYP19, keine Zytotoxizität, niedrige Plasmaproteinbindung, eine exzellente Bioverfügbarkeit und eine starke Hemmung der Aldosteronbiosynthese in vivo. Nach erweiterten pharmakologischen Untersuchungen und gegebenenfalls erforderlichen strukturellen Optimierungen sollen aus den vorgestellten Substanzklassen Entwicklungskandidaten hervorgehen.
2008-12-18
2017-07-12T07:26:23Z
2008-12-18
2008
2011-02-11
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-19987
hdl:20.500.11880/22601
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22545
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226022019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Cationically-modified nanoparticles for the pulmonary delivery of the telomerase inhibitor 2';-O-Methyl RNA for the treatment of lung cancer
Kationisch modifizierte Nanopartikel für die pulmonale Applikation des Telomerase-Inhibitors 2';-O-Methyl-RNA zur Behandlung des Lungenkarzinoms
Nafee, Noha
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Nanopartikel
Chitosan
Telomerase
Lungenkrebs
Antisense-Oligonucleotide
nanoparticles
chitosan
telomerase
lung cancer
antisense oligonucleotides
Lung cancer is one of the main causes of cancer-related death worldwide. One of the reasons behind the extensive tumour growth is telomerase enzyme, which is notably expressed in cancer cells. Recent strategies for cancer therapy include, therefore, telomerase inhibition with antisense RNA. A major challenge is the weak cellular uptake of these nucleotide-based drugs which necessitates the choice of appropriate carrier systems. The aim of this study was hence to evaluate chitosan-modified PLGA nanoparticles (cNP) as carrier for the antisense oligonucleotide 2'-O-Methyl-RNA (OMR) and their efficacy as inhalation therapy. Modification of the process parameters revealed the tuneability of the NP synthesis in terms of size and surface charge. Studying the cellular uptake of fluorescent cNPs with increasing amounts of chitosan showed better uptake in A549 than in Calu-3 cells. Chitosan significantly improved the uptake and binding with OMR; however, higher chitosan content reduced the uptake efficiency. Uptake studies under in vivo mimicking conditions using air-interface cultures showed superior cellular uptake of OMR/cNP nanoplexes compared to free OMR. As a proof of the concept, the ability of OMR to reduce telomerase activity was demonstrated.
In conclusion, the concept of telomerase inhibition based on nanoscale delivery of antisense oligonucleotides represents a step forward to a new generation of cancer therapeutics.
Lungenkrebs ist einer der Hauptgründe für krebsbasierten Todesfälle weltweit. Mit einer der Ursachen für das ungehemmte Wachstum von Krebszellen ist das Enzym Telomerase, das in vermehrtem Maße in Krebszellen auftritt. Eine interessante Behandlungsstrategie besteht daher in der Hemmung dieses Enzyms. Eine Hemmung der Telomerase ist mit antisens-RNA möglich. Um solche Arzneistoffe in die Zelle zu transportieren sind jedoch geeignete Trägersysteme notwendig. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung von Chitosan-modifizierten PLGA Nanopartikeln (cNP) als Trägersystem für das Antisense-Oligonukleotid 2'-O-Methyl-RNA (OMR) sowie ihres möglichen Einsatzes für einer Inhalationstherapie.
Die Änderung der Prozessparameter erlaubt eine maßgeschneiderte Synthese der cNP hinsichtlich Größe und Ladung. Die Untersuchung der NP in Zellkultur-Modellen ergab eine bessere Aufnahme in A549 als in Calu-3 Zellen. Die zelluläre Aufnahme unter Verwendung von realitätsnahen "Air-interface"-Kulturen zeigte zudem auch eine überlegene Aufnahme von partikelbasierten Systemen im Vergleich zu freien Oligonukleotiden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Telomerase -Aktivität in diesen Zellen tatsächlich gehemmt war.
In der vorliegenden Arbeit konnte das Konzept der Telomerase-Hemmung zur Krebsbehandlung, basierend auf Komplexen von Antisense-Oligonukleotiden mit nanoskaligen Trägersystemen, erfolgreich in vitro demonstriert werden.
2009-01-07
2017-07-12T07:26:23Z
2009-01-07
2008
2011-10-27
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-20295
hdl:20.500.11880/22602
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22546
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226062019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Charakterisierung der Nicotianamin Synthase Genfamilie in Arabidopsis thaliana im Kontext der Metallhomöostase
Characterisation of the nicotianamine synthase gene family in Arabidopsis thaliana in the context of metal homeostasis
Klatte, Marco
Bauer, Petra
ddc:500
Nicotianaminsynthase
Eisen
Ackerschmalwand
Genfamilie
NA
Metallhomöostase
Arabidopsis
nicotianamine
NA
metal homeostasis
gene families
Arabidopsis
Die nicht proteinogene Aminosäure Nicotianamin (NA) ist ein in höheren Pflanzen ubiquitärer und essentieller Chelator von Schwermetallen. In Gramineen fungiert NA als direkte biochemische Vorstufe in der Synthese der Phytosiderophore und ist damit indirekt an der Aufnahme von Fe und Zn in die Wurzel beteiligt. Wie die NA freie, semi-sterile Tomatenmutante chloronerva zeigt, erfüllt NA auch in Nicht-Gramineen eine essentielle Funktion, die bislang jedoch nicht genau verstanden ist. Mit zunehmender Verbreitung der Modellpflanze Arabidopsis thaliana ergaben sich vielfältige neue, für Tomate nicht verfügbare Untersuchungsmethoden, die einen Transfer der Erforschung des NA Mangels auf A. thaliana für langfristige Studien attraktiv machten.
In der vorliegenden Arbeit wird die Generierung und Charakterisierung einer auf T-DNA Mutagenese beruhenden und die vier Nicotianamine Synthase (NAS) Gene betreffenden Mutantenkollektion in A. thaliana beschrieben. Die Analyse der fertilen nas4x-1 Mutante ergab eine geringe NAS Restaktivität, die sich in deutlich verringerten, aber detektierbaren NA Gehalten äußerte. Dennoch wurden umfassende Veränderungen in den Metallgehalten sowie der Genexpression bekannter, in der Metallhomöostase involvierter Gene beobachtet, wodurch eine bessere Integration der NAS Gene in das Netzwerk der Metallhomöostase ermöglicht wurde. Die durchgeführten Analysen deuteten insbesondere auf eine essentielle Funktion des NA in der Entwicklung der reproduktiven Organe hin. Darüber hinaus wurden Hinweise auf eine essentielle Funktion des NA in der Toleranz gegenüber dem Schwermetall Nickel sowie gegenüber Eisenmangel gewonnen. NA ist demnach essentiell sowohl in der Ernährung als auch in der Detoxifizierung von Metallen. Darüber hinaus erfüllt es essentielle Aufgaben in der vegetativen und reproduktiven Phase der Pflanzenentwicklung.
The non-proteinogenic amino acid nicotianamine (NA) is essential for chelation and transport of iron and other micronutrient metal ions in higher plants. In graminceous plants, NA is the direct precursor in the synthesis of phytosiderophores and thus directly involved in the acquisition and uptake of essential metal ions from the soil. However, due to the analysis of the NA free and semi-sterile tomato mutant chloronerva, an essential role of NA also in non-graminaceous plants is generally accepted. With the establishment of Arabidopsis thaliana as the major dicot model plant many new methods were developed which are not available in Solanaceous species. Thus, a change of the model species to investigate loss of NA in A. thaliana, became attractive.
Due to the NAS gene family structure in A. thaliana multiple nas mutants were constructed, enabling the identification of intermediate nas mutant phenotypes to study NA production and transport during reproduction. The nas4x-1 mutant, being mutated at all four NAS genes, contained drastically reduced but still detectable amounts of NA, enabling the mutant to sustain its life cycle. Anyway, global changes in metal homeostasis and the expression of known metal homeostasis genes were detected in the nas4x-1 mutant, leading to a better understanding and integration of the NAS genes into the network of metal homeostasis. The obtained results strongly indicate an essential role of NA in the development of flowers and seeds. Furthermore, it was shown that an increasing number of nas mutations leads to a higher sensitivity against high amounts of nickel as well as iron deficiency. Thus, NA plays essential roles in metal nutrition and metal detoxification both at vegetative and reproductive stage of plant development.
2009-01-23
2017-07-12T07:26:24Z
2009-01-23
2008
2009-01-23
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-20673
hdl:20.500.11880/22606
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22550
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226162019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Untersuchungen zu einem neuartigen Abbauweg der 1,5-Anhydro-D-fructose in Rhizobien an dem Modellorganismus Sinorhizobium meliloti 1021 : Klonierung und Charakterisierung der beteiligten Enzymsysteme
Analysis of a novel pathway of the 1,5-Anhydro-D-fructose in rhizobia using a model organismus Sinorhizobium meliloti 1021 : cloning and characterisation of the participating enzyme systems
Stosik, Beata
Giffhorn, Friedrich
ddc:500
Anhydrofructose-Reductase <1
5-Anhydro-D-Fructose-Reductase>
Rhizobium meliloti
Putidaredoxin-Reduktase
anhydrofructose-reductase <1
5-anhydro-D-fructose-reductase>
Rhizobium meliloti
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Abbauweg des neuartigen Zuckers 1,5-Anhydro- D-fructose (1,5-AF) in Sinorhizobium meliloti 1021, einem Modellbakterium dessen Genomsequenz bekannt ist, aufgeklärt. Die beteiligten Enzyme Anhydrofructose- Reduktase (AFR) und eine P450-Monooxygenase (CYP) wurden in Zellextrakten nachgewiesen und charakterisiert. Die postulierten Reaktionen wurden mit den rekombinanten Enzymen in vitro verifiziert. Der erste Reaktionsschritt wird durch AFR katalysiert, die 1,5-AF stereoselektiv zu 1,5-Anhydro-D-mannitol (1,5-AM) reduziert. Die AFR aus S. meliloti 1021 ist ein dimeres, strikt NADPH-abhängiges Enzym 74,1 kDa und hat 80 % Sequenzidentität zu AFR aus S. morelense S-30.7.5. Die für S. morelense S-30.7.5 postulierte Hydroxylierung von 1,5-AM an C-1 zu D- Mannose durch ein CYP-System konnte experimentell bestätigt werden. Zwei putativ für CYP kodierende ORFs wurden aus S. meliloti kloniert und charakterisiert. Nur die aus dem ORF Y01812 erhaltene Monooxygenase konnte in aktiver Form exprimiert werden. Für den Elektronentransfer von NADH auf die MO1812 wurden aus P. putida die Gene der Putidaredoxin-Reduktase (camA) und des Putidaredoxins (camB) kloniert und mit der MO1812-(His)6 fusioniert. Im Test mit 1,5-AM war das Fusionsprotein aktiv. Die Beteiligung der Monooxygenase an dem Abbauweg von 1,5-AF in S. meliloti 1021 wurde zusätzlich durch Deletion des Gens Y01812 verifiziert, wobei die Fähigkeit des Bakteriums zum Wachstum auf 1,5-AF verloren ging.
A catabolic pathway of the new sugar 1,5-anhydro-D-fructose (AF) in Rhizobia was clarified in the frame of this work. S. meliloti 1021 strain was chosen as a model due to the complete genetic data available. The enzymes of this pathway were identified in cellextracts and characterized. Their participation in these reactions was verified. The first reaction is catalysed througt AF reductase which reduces stereoselective AF to 1,5-anhydro-D-mannitol (AM). The afr-gene from S. meliloti has 1002 bp and the derived polypeptide showed 80 % identity with the AFR from S. morelense. The AF reductase from S. meliloti is a strictly NADPH dependent dimeric protein of 74 kDa and it has 80 % homology to the AFR from S. morelense S-30.7.5. The for S. morlense S-30.7.5 C-1 postulated oxygenation of 1,5-AM to the D-mannose through a CYP system could be verified. Two putative CYP coding ORF';s from S. meliloti were cloned and characterized. Only the monooxygenase from the ORF Y01812 could be expressen in an active form. For the electron transport from NADH the MO1812 two genes: putidaredoxin reduktase (camA) and putidaredoxin (camB) from P. putida were cloned and fused with the monooxygenase MO1812-(His)6. The fusion protein was in the test with 1,5-AM activ. To confirm the involvement of this monooxygenase in the 1,5-anhydro-D-fructose pathway the monooxygenase-gene was accessorily knocked out in S. meliloti 1021, what resulted in no-growth of the organism on 1,5-AF.
2009-02-04
2017-07-12T07:26:26Z
2009-02-04
2008
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-20697
hdl:20.500.11880/22616
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22560
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226212019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
New therapeutic options for the treatment of lung cancer by telomerase inhibition
Neue Therapieoptionen zur Behandlung des Bronchialkarzinoms durch Telomeraseinhibition
Tätz, Sebastian
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Lungenkrebs
Telomerase
Telomer <Molekulargenetik>
Nanopartikel
Liposom
Lipoplexe
Antisense-Oligonucleotide
Antisense-RNS
BRACO19
siRNA
Biopharmazeutisches Klassifizierungssystem
PLGA
DOTAP/DOPE
BRACO19
siRNA
Biopharmaceutics Classification System
PLGA
DOTAP/DOPE
The enzyme telomerase plays an important role in cell immortalization and hence cancer development. It can be detected in most kinds of tumors but is not expressed in the majority of healthy cells. Therefore, telomerase inhibition appears to be a promising approach for a specific cancer therapy with reduced side effects. The work presented here concentrated on the treatment of non-small cell lung cancer by telomerase inhibition and can be divided into three parts:
1. Characterization of the G-quadruplex stabilizing substance BRACO19 under biopharmaceutical and stability aspects. BRACO19 showed a poor permeability across biological barriers and was instable under physiological conditions.
2. Evaluation of cationic chitosan/PLGA nanoparticles as a carrier system for 2';-O-Methyl-RNA antisense oligonucleotides (2OMR), which was directed against the template region of the telomerase specific RNA hTR. The chitosan content in the particles considerably influenced the uptake improvement of 2OMR into cells. Despite a poor complex stability in physiological media a successful inhibition of telomerase activity in lung cancer cells could be achieved.
3. Targeted delivery of anti-telomerase siRNA to CD44-overexpressing lung cancer cells using hyaluronic acid modified DOTAP/DOPE liposomes. These liposomes efficiently bound siRNA, protected it from degradation by nucleases and increased its uptake into CD44-overexpressing lung cancer cells. The modification improved the colloidal stability of lipoplexes in cell culture medium and their cytotoxicity.
Das Enzym Telomerase spielt eine wichtige Rolle bei der Immortalisierung von Zellen und damit auch bei der Entwicklung von Krebserkrankungen. Es wird in einer Vielzahl von Tumoren exprimiert, jedoch nicht in den meisten gesunden Zelltypen. Durch seine Hemmung erhofft man sich eine sehr spezifische und nebenwirkungsarme Krebstherapie. Die durchgeführten Arbeiten konzentrierten sich auf die Behandlung von nicht-kleinzelligen Lungenkrebs mittels Telomeraseinhibitoren und unterteilen sich in drei Teile:
1. Charakterisierung des G-Quadruplex stabilisierenden Wirkstoffs BRACO19 unter biopharmazeutischen und stabilitätsrelevanten Aspekten. BRACO19 permeierte schlecht über biologische Barrieren und war unter physiologischen Bedingungen instabil.
2. Evaluierung von kationischen Chitosan/PLGA-Nanopartikeln als Trägersystem für ein gegen die Template Region der Telomerase-spezifischen RNA hTR gerichtetes 2';-O-Methyl-RNA Antisense Oligonukelotid. Der Chitosangehalt der Partikel beeinflusste die Aufahmeverbesserung von 2OMR in Zellen deutlich. Trotz geringer Komplexstabilität in physiologischen Medien konnte das Enzym Telomerase in Lungenkrebszellen effizient gehemmt werden.
3. Targeted Delivery von Anti-Telomerase siRNA mit Hilfe von Hyaluronsäure-modifizierten kationischen DOTAP/DOPE Liposomen in CD44-überexprimierende Lungenkrebszellen. Diese Liposomen konnten effizient die siRNA binden, gegen Abbau durch Nucleasen schützen und steigerten ihre Aufnahme in CD44-überexprimierende Lungenkrebszellen. Weiterhin verbesserte die Modifizierung die kolloidale Stabilität der Lipoplexe in Zellkulturmedium sowie deren Zytotoxizität.
2009-04-02
2017-07-12T07:26:28Z
2009-04-02
2008
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-21226
hdl:20.500.11880/22621
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22565
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226222019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Synthese und zellbiologische Untersuchung intelligenter, katalytisch aktiver Wirkstoffe
Synthesis and biochemical evaluation of intelligent, catalytic active agents
Mecklenburg, Susanne
Jacob, Claus
ddc:500
Oxidativer Stress
Antioxidans
Selen
Tellur
Chinon
Redox-Katalyse
intelligente Wirkstoffe
Antikrebs-Wirkstoffe
Makrozyklus
Zellkulturstudien
oxidative stress
intelligent drugs
antioxidant
anti cancer agents
selenium
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Erforschung neuartiger Wirkstoffe, gegen Krankheiten bei denen oxidativer Stress (OS) auftritt. Dazu gehören Krankheiten wie Parkinson, Alzheimer oder Rheumatoide Arthritis. Auch Krebs wird mit dem Überwiegen von Pro- gegenüber Antioxidantien in Zusammenhang gebracht.
Im Kampf gegen Oxidantien spielen Katalysatoren, die natürliche Enzyme nachahmen können, eine wichtige Rolle. Da nicht nur Superoxidanionen und Wasserstoffperoxid, sondern auch labile Metallionen OS verursachen, sollen multifunktional gebaute Moleküle, die katalytische mit metallbindenden Eigenschaften vereinen, OS als Multi-Stressoren-Ereignis optimal bekämpfen.
Ein weiterer Schwerpunkt liegt auf Krebswirkstoffen. Von besonderem Interesse sind effektive und vor allem selektive katalytische Wirkstoffe, mit Glutathion-Peroxidase-ähnlicher Aktivität. Die "intelligenten" Katalysatoren sollen auf oxidativ gestresste Krebszellen angepasst sein, aber nicht zytotoxisch auf Zellen mit normalen Redoxverhältnissen wirken.
Eine Reihe von multifuktional gebauten Wirkstoffen, auf Basis von Chalkogen- und Chinon-Redoxzentren sowie Makrozyklen, wurde synthetisiert und in Zellkulturstudien untersucht. Zu den vielversprechendsten Stukturen gehören zwei Verbindungen, welche einen Schutz vor dem mit OS assoziierten Zelltod vermitteln. Mehrere Verbindungen konnten gefunden werden, die Krebszellen mit erhöhten intrazellulären Konzentrationen an oxidativen Stressoren selektiv töten.
The thesis covers the development of new active agents against illnesses which are associated with oxidative stress (OS). Parkinson's disease, Alzheimer's disease or Rheumatoid Arthritis do belong to it. Cancer is as well associated with the overbalance of pro- against antioxidants.
Catalysts which mimic natural enzyms play an important role in modern drug development. Not only superoxide anions and hydrogen peroxide but also labile metal ions can cause OS. Multifunctional molecules, which combine catalytic and metal binding properties should treat OS as multi-stressor event in an optimal way.
Another focal point are drugs for cancer therapy. Of special interest are effective and above all selective catalytic agents with gluthatione peroxidase-like activity. The "intelligent" catalysts should distinguish between cancer cells under OS and cells under normal redox conditions.
A range of multifunctional built drugs has been synthesized containing chalkogen and quinone redox centers as well as macrocycles, and explored in cell culture studies. To the most promising stuctures belong two compounds, which protect cells from cell death caused by OS. Several compounds are able to kill cancer cells selectively, that are more oxidatively stressed.
2009-04-17
2017-07-12T07:26:28Z
2009-04-17
2008
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-21370
hdl:20.500.11880/22622
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22566
ger
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Alle Ressourcen in diesem Repository sind urheberrechtlich geschützt
oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226262019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Studies on the biosynthesis and heterologous expression of complex secondary metabolites from streptomycetes
Untersuchungen der Biosynthese und heterologen Expression komplexer Naturstoffe aus Streptomyceten
Binz, Tina Maria
Müller, Rolf
ddc:500
Streptomycetaceae
Antibiotikum
Heterologe Genexpression
Gencluster
Naturstoffe
Streptomyceten
natural products
biosynthetic gene cluster
heterologous expression
streptomycetes
The heterologous expression of natural product biosynthetic pathways is of increasing interest in biotechnology and drug discovery. This approach enables the production of complex metabolites in more amenable host organisms and provides the basis for the generation of novel analogs through genetic engineering. In this thesis, we describe a straightforward strategy for the heterologous expression of the highly complex phenalinolactone biosynthetic pathway, which was recently cloned from Streptomyces sp. Tü6071. Using Red/ET recombineering, the phenalinolactone pathway was reconstituted from two cosmids and heterologously expressed in several Streptomyces strains. The established expression system now provides a convenient platform for functional investigations of the biosynthetic genes and the generation of novel analogs, by genetic engineering of the pathway in Escherichia coli.
The second part of this thesis describes work on a distinct class of secondary metabolites, the GE81112 tetrapeptide family. We developed a strategy for the cloning and identification of the GE81112 biosynthetic gene cluster, in order to investigate the biosynthetic pathway in detail. Generation of a cosmid library enabled us to identify the corresponding biosynthetic gene cluster on two overlapping cosmids. In parallel, we established methods to manipulate the strain genetically, allowing us to verify the identity of the GE81112 gene cluster by gene inactivation experiments. In addition, we characterized several proteins from the pathway using enzymatic assays in vitro. Taken together, these data have enabled us to propose a preliminary model for GE81112 biosynthesis. The results also open the door to developing new derivatives of these promising compounds by genetic engineering.
Die heterologe Expression komplexer Naturstoff-Biosynthesewege spielt eine immer größer werdende Rolle bei der Entdeckung und Modifikation von Wirkstoffen aus der Natur und gewinnt somit zunehmend an Bedeutung in der biotechnologischen Forschung. Diese Methode ermöglicht die Produktion komplexer Metabolite in leicht handhabbaren Wirtsorganismen und bildet so die Grundlage für die Entwicklung neuer Naturstoffderivate durch genetische Manipulation der Biosynthesewege. Die vorliegende Arbeit beschreibt eine innovative Strategie für die heterologe Expression des komplexen Phenalinolacton- Biosynthesewegs aus dem Streptomyceten Tü6071. Mit Hilfe der Red/ET Rekombination wurde dieses Gencluster, das auf 2 Cosmiden vorlag, kloniert und in verschiedenen Streptomyceten-Stämmen heterolog exprimiert. Das somit etablierte Expressionssystem bietet nun die Möglichkeit, durch gezielte genetische Manipulation der Biosynthesewege in Escherichia coli und anschließende heterologe Expression neue, möglicherweise wirksamere Naturstoffe und Naturstoffderivate zu entwickeln.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Untersuchungen zur Biosynthese einer ungewöhnlichen Klasse von Sekundärstoffen: den GE81112 Tetrapeptiden. Um die zugrundeliegende Biosynthese dieser Naturstoffe nun detailliert zu untersuchen, wurde eine Strategie für die Klonierung und Identifizierung des entsprechenden Genclusters entwickelt, das schließlich auf zwei überlappenden Cosmiden identifiziert wurde. Gleichzeitig konnten Methoden zur genetischen Manipulation des Stammes entwickelt werden, die es ermöglichten das Gencluster durch Geninaktivierungsexperimente zu identifizieren. Mit Hilfe der erhaltenen Ergebnisse konnte schließlich ein erstes Model für die GE81112 Biosynthese erarbeitet werden. Die in dieser Arbeit erhaltenen Einblicke in die Biosynthese können in Zukunft einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung neuer GE81112 Derivate leisten.
2009-05-11
2017-07-12T07:26:29Z
2009-05-11
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-21457
hdl:20.500.11880/22626
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22570
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226292019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Präklinische Wirkstoffentwicklung : Assays zur Bewertung von Hemmstoffen des Hepatitis C Virus Eintritts sowie von Inhibitoren der Acetylcholinesterase und der 17beta-HSD1
Preclinical drug development : assay for validation of hepatitis C virus entry inhibitors and inhibitors of acetylcholinesterase and 17beta-HSD 1
Ziegler, Sigrid
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Hepatitis-C-Virus
Inhibitor
Arzneimittelentwicklung
CD81-LEL
Entry-Inhibitoren
FACS basierter medium-throughput Assay
CD81-LEL
entry Iinhibitors
FACS based medium-throughput assay
Weltweit sind 300 Millionen Menschen mit dem Hepatitis C Virus infiziert. Die gängige Therapie aus Ribavirin und Interferon greift in weniger als 60 % aller Fälle. Die Schlüsselproteine der viralen Infektion sind das virale Glykoprotein E2 und der humane CD81-Rezeptor. Die Kenntnis der beteiligten Aminosäuren und das Vorliegen von Röntgen-kristallstrukturen machen CD81 zu einem vielversprechenden Ziel für die Hemmstoffentwicklung. In silico Untersuchungen zeigten, dass die CD81-E2 Interaktion durch kleine Moleküle unterbrochen werden kann. Darauf aufbauend wurde ein FACS-basierter Test entwickelt und Verbindungsklassen mit deutlichem antiviralem Effekt gefunden. Die Hemmwirkung konnte durch Untersuchungen an HCV in Zellkultur bestätigt werden.
Die Entwicklung von CYP11B2-Inhibitoren als Angriffspunkt in der Therapie chronischer Herzinsuffizienz und Myokardfibrose führte zu neuen hochpotenten Verbindungsklassen. Neben der Untersuchung auf Selektivität wurde auf Hemmung hepatischer CYP-Enzyme, der CYP17 und CYP19 untersucht. Die Hemmung der Acetylcholinesterase wurde im Rahmen dieser Arbeit bestimmt. Keine der untersuchten Verbindungen wies eine Hemmung auf. Weiterführende in vivo Untersuchungen können angeschlossen werden.
Bei der Behandlung estrogenabhängiger Erkrankungen wurde 17β-HSD1 als vielversprechender Angriffspunkt evaluiert, für welchen neue Klassen nichtsteroidaler Hemmstoffen mit hervorragenden pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften gefunden wurden. Für das abschließende Proof of Concept wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Vorselektion nach Sequenz-Alignments vorgenommen. Hemmdaten bezüglich Hamster-17β-HSD1 / 2 zeigten, dass alle getesteten Substanzen eine verminderte Hemmwirkung und einen Verlust der Selektivität aufwiesen. Das Proof of Concept sollte folglich an Menschenaffen oder an weiteren, detailliert untersuchten Spezies erbracht werden.
Worldwide 300 million people are infected with hepatitis C virus. The current therapy consisting of ribavirin and modified interferon fails in about 40 % of all cases.
The key proteins of viral infection are the viral envelope glycoprotein E2 and the human CD81-receptor. The knowledge of the interaction sites and the availability of X-ray structures make CD81 a promising drug target. In silico work indicates that the CD81-E2 interaction can be interrupted by small molecules. Based on this finding a FACS-based medium throughput assay was developed leading to compound classes with pronounced antiviral effect. This effect could be confirmed by experiments using HCV in cell culture.
The development of inhibitors of CYP11B2 as target for disorders like congestive heart failure and myocardial fibrosis led to new highly potent classes of inhibitors. Besides the examination of selectivity, inhibition of hepatic CYP enzymes, CYP17 and CYP19 were examined. Inhibition of acetylcholinesterase was determined in the course of this work. All compounds were inactive. Continuing in vivo examination can follow.
Concerning treatment of estrogen dependent diseases 17β-HSD1 has been evaluated as a promising target. New classes of non steroidal inhibitors with excellent pharmacokinetic and pharmakodynamic properties have been found. In the course of this work sequence alignments for a preselection of species were performed. Detection of inhibition concerning hamster 17β-HSD1 / 2 revealed that all tested compounds display a decrease of inhibition just as well as loss of selectivity. The proof of concept should be performed either in great apes or in further, more detailed investigated species.
2009-05-20
2017-07-12T07:26:30Z
2009-05-20
2008
2009-05-20
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-21569
hdl:20.500.11880/22629
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22573
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226372019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Natural product biosynthesis in myxobacteria : studies on enzymatic versatility and secondary metabolite diversity
Naturstoff-Biosynthese in Myxobakterien : enzymatische Vielseitigkeit und Diversität der Sekundärmetabolite
Krug, Daniel
Müller, Rolf
ddc:500
Naturstoff
Sekundärmetabolit
Myxobakterien
Biosynthese
Vielfalt
Diversität
natural products
secondary metabolites
biosynthesis
myxobacteria
diversity
In this work, the biosynthesis of secondary metabolites in myxobacteria was investigated, with particular focus on the functional and biochemical characterization of enzymes furnishing biosynthetic pathways with unusual building blocks. A novel member of the tyrosine aminomutase (TAM) enzyme family, CmdF, was shown to supply (R)-beta-tyrosine for incorporation into the chondramides by Chondromyces crocatus. Site-directed mutagenesis demonstrated the feasibility of modulating the stereoselectivity exhibited by CmdF through genetic engineering. The cloning and characterization of additional TAMs revealed a high degree of evolutionary diversification within the emerging TAM enzyme family. Furthermore, the structural elucidation and biosynthesis of newly discovered metabolites from Stigmatella aurantiaca, the imidacins, is reported. These compounds consist of a fatty-acid like scaffold, but additionally feature an unique imidazole acryl moiety and a rare cyclopropane ring. Imidacin formation depends on the supply of an unprecedented urocanic acid precursor by a histidine ammonia lyase (HAL), revealing for the first time the involvement of HAL in bacterial secondary metabolism.
In addition, a metabolomics-based approach for the mining of myxobacterial metabolite profiles was devised. High-resolution mass spectrometry, combined with statistical interpretation by principal component analysis (PCA), was employed to highlight compounds which constitute significant differences in a set of highly complex samples. This technique uncovered a strikingly high level of intraspecific diversity in the secondary metabolome of Myxococcus xanthus.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Biosynthese von myxobakteriellen Naturstoffen, mit Schwerpunkt auf der funktionellen und biochemischen Charakterisierung von Enzymen, die ungewöhnliche Vorläufer für biosynthetische Stoffwechselwege zur Verfügung stellen. Es konnte gezeigt werden, dass (R)-beta-Tyrosin — ein Bestandteil der Chondramide aus Chondromyces crocatus — durch die neuartige Tyrosin-Aminomutase (TAM) CmdF gebildet wird. Mittels gezielter Mutagenese wurden Möglichkeiten zur Beeinflussung der Stereoselektivität von CmdF aufgezeigt. Die Klonierung und Characterisierung weiterer TAM Enzyme offenbarte einen hohen Grad an evolutionärer Diversifizierung innerhalb der erweiterten TAM Familie. Außerdem wird die Strukturaufklärung und die Biosynthese neu entdeckter Metabolite aus Stigmatella aurantiaca beschrieben, welche Imidacine genannt wurden. Diese Verbindungen besitzen eine fettsäureartige Grundstruktur, zeichnen sich jedoch zusätzlich durch eine äußerst seltene Imidazolacrylgruppe und einen Cyclopropanring aus. Die Biosynthese der Imidacine ist abhängig von der Bereitstellung einer Urocansäure-Startereinheit durch eine Histidin-Ammoniumlyase (HAL), und stellt damit das bisher einzige Beispiel für die Beteiligung von HALs am bakteriellen Sekundärstoffwechsel dar.
Es wurde darüber hinaus ein "Metabolomics"-basierter Ansatz zur vertieften Analyse der Sekundärmetabolitenprofile von Myxobakterien entwickelt. Hochauflösende massenpektrometrische Messungen wurden mit einem statistischen Auswertungsverfahren (PCA, "Principal Component Analysis") kombiniert, um solche Substanzen zu identifizieren, die signifikante Unterschiede innerhalb einer Probenserie mit hoher Komplexität darstellen. Die Anwendung dieser Methode enthüllte die erstaunlich hohe Diversität des sekundären Metaboloms der Spezies Myxococcus xanthus.
2009-06-18
2017-07-12T07:26:33Z
2009-06-18
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-21922
hdl:20.500.11880/22637
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22581
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226402019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Natural polysulfides- reactive sulfur species from Allium with applications in medicine and agriculture
Natürliche Polysulfide- reaktive Schwefel-Arten von Allium und die Anwendung in Medizin und Landwirtschaft
Anwar, Awais
Jacob, Claus
ddc:500
Knoblauch
Krebszelle
Pestizid
Polysulfide
U 937 Zellen
Allium
Diallyltetrasulfide
U937
Pesticides
Natural sulfur compounds from plants, bacteria, fungi and animals frequently exhibit interesting biological activities, such as antioxidant, antimicrobial and anticancer activity. Considering the recent developments in medicine (e.g. oxidative stress in ageing, antibiotic resistant bacteria, and selective anticancer agents) and Agriculture (e.g. 'green'; pesticides), several of these compounds have become the focus of interdisciplinary research. Among the various sulfur agents isolated to date, polysulfides, such as diallyltrisulfide, diallyltetrasulfide (from garlic) and dipropyltrisulfide, dipropyltetrasulfide (from onion), are of particular interest, since they combine an unusual chemistry and biochemical mode(s) of action with a distinct biological activity, which includes antimicrobial activity and cytotoxicity against certain cancer cells. As part of this PhD thesis, the activity of diallyltrisulfide and diallyltetrasulfide against the fairly 'robust'; Caco-2 colon cancer cell line and induction of apoptosis and cell cycle arrest in U937 cells have been confirmed. Accordingly, diallyltetrasulfide triggered the programmed cancer cell death- both via the extrinsic and intrinsic pathway. Similarly, these polysulfides showed a good activity in nematode toxicity assays considering them as potential green nematicides. Controls with the long chain carbon analogue 1,9-decadiene eliminate the possibility of solely lipophilic effects of diallyltetrasulfide and, together with the 'ranking'; of activity, point toward a special sulfur redox chemistry which emerges when shifting from the di- to the trisulfide. The electrochemical studies and thiol oxidation assays, however, count against the notion of diallyltrisulfide and diallyltetrasulfide as effective oxidants. On the contrary, the rather negative oxidation and reduction potentials associated with these agents point toward a reducing chemistry, which is confirmed in the Nitrotetrazolium Blue assay. It is therefore likely that diallyltrisulfide and diallyltetrasulfide are reduced inside the cancer cells to perthiols and hydropolysulfides, which in turn trigger a lethal oxidative burst via superoxide radical anion formation. Further interdisciplinary studies are required to investigate in more detail the rather complicated chemical and biochemical processes which ultimately may explain the biological activity which is clearly associated with many natural polysulfides.
Natürliche Schwefelverbindungen von Pflanzen, Bakterien, Pilzen und Tieren zeigen oft interessante biologische Aktivitäten, wie antioxidative, antimikrobiale und Antikrebs-Wirkungen. Angesichts der derzeitigen Entwicklung in Medizin (z.B. oxidativer Stress beim Alterungsprozess, gegen Antibiotika resistente Bakterien und selektive Antikrebs-Mittel) und Landwirtschaft (z.B. "grüne" Pestizide) haben verschiedene dieser Verbindungen ein besondeses Augenmerk in interdisziplinärer Forschung erhalten. Unter diversen bislang isolierten Schwefel-Agenzien sind Polysulfide, wie Diallyltrisulfid, Diallyltetrasulfid (von Knoblauch), so wie Dipropyltrisulfid und Dipropyltetrasulfid (von Zwiebeln) von besonderem Interesse, und diese Verbindungen vereinen eine ungewöhnliche Chemie und biochemische Wirkungsweise mit einer ausgeprägten biologischen Aktivität, welche antimikrobiale Aktivität and Zytotoxizität gegenüber bestimmten Krebszellen umfasst, Als Teil dieser Dissertation wurde die Aktivität von Diallyltrisulfid und Diallyltetrasulfid gegen die "robuste" Caco-2 Darmkrebs-Zellinie, so wie die Induktion von Apoptose und Zellzyklus-Arrest in U937-Zellen bestätigt. Dementsprechend löst Diallyltetrasulfid programmierten Zelltod über den extrinsischen als auch den intrinsischen Weg aus. Gleichermaßen zeigten diese Polysulfide eine gute Aktivität im Nematoden-Toxizitäts-Assay, welches sie als potenzielle grüne Nematizide im Betracht ziehen lässt. Durch Kontrollen mit dem langkettigen Kohlenstoff-Analogen 1,9-Decadien lässt sich die Möglichkeit der alleinigen lipophilen Effekte von Diallytetrasulfid ausschließen, was zusammen mit dem "Ranking" der Aktivitäten auf eine besondere Schwefel-Redoxchemie hindeutet, wie sie beim Übergang vom Di- zum Trisulfid auftritt. Die elektrochemischen Studien und Thiol-Oxidations-Assays sprechen gegen Diallyltrisulfid und Diallyltetrasulfid als effektive Oxidantien. Im Gegensatz, die eher negativen Oxidations- und Reduktionspotentiale deuten auf eine Reduktionschemie hin, welches durch das Nitrotetrazoliumblau-Assay bestätigt wurde. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass Diallyltrisulfid und Diallyltetrasulfid in Krebszellen zu Perthiolen und Hydropolysulfiden reduziert werden, die wiederum einen letalen oxidativen Burst durch Superoxid-Radikalanionen-Bildung auslösen.
2009-06-29
2017-07-12T07:26:34Z
2009-06-29
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-22376
hdl:20.500.11880/22640
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22584
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226492019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA, "Ecstasy") : studies on MDMA metabolism and pharmacokinetics in humans and squirrel monkeys
3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA, "Ecsatsy") : Untersuchungen der Verstoffwechselung und Pharmakokinetiken in Mensch und Totenkopfaffe
Müller, Melanie
Maurer, Hans
ddc:500
Metabolismus
Ecstasy
Pharmakokinetik
ecstasy
MDMA
metabolism
pharmacokinetics
In the presented studies, the pharmacokinetic profile and metabolic pattern of MDMA in different species were determined. Furthermore species-specific differences on conjugate cleavage of the phase II metabolites were investigated in human, squirrel monkey, and rat. After optimization of cleavage conditions respectively for each species, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)-based assay procedures were developed and focused on determination of the parent compound and its corresponding major metabolites in plasma of different species. After administration of different oral MDMA doses pharmacokinetics for MDMA and its metabolites (MDA, HHMA, and HMMA) were determined in squirrel monkey and human. In both species nonlinear pharmacokinetics were firmly established with nonlinear MDMA accumulation occurring at plasma MDMA levels that develop in humans after typical doses. Comparison of pharmacokinetics of MDMA and its metabolites between humans and squirrel monkeys revealed the squirrel monkey as appropriate model for predicting outcomes of MDMA exposure in humans depending upon the pharmacokinetic parameter of MDMA or its metabolites that mostly influences the outcome of interest.
In dieser Dissertation wurden Metabolismus und Pharmakokinetiken von MDMA in verschiedenen Spezies untersucht. Desweiteren wurden Studien bezüglich unterschiedlicher Entstehung von Phase II Stoffwecheselprodukten in Mensch, Totenkopfäffchen und Ratte durchgeführt. Nachdem die Reaktionsbedingungen zur Konjugatspaltung für jede Spezies entsprechend optimiert wurden, konnten Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-basierte Verfahren zur Quantifizierung von MDMA und seinen Hauptmetaboliten (MDA, HHMA und HMMA) in Plasma von Mensch und Totenkopfaffe entwickelt werden. Nach Behandlung mit verschiedenen Dosierungen von MDMA zeigten Mensch und Affe eine nicht-lineare Pharmakokinetik der Muttersubstanz, und zwar nach Plasmaspiegeln, die beim Menschen bereits nach typischer Ecstasy-Einnahme auftreten. Vergleich der Pharmakokinetiken zwischen beiden Spezies führte zu der Schlussfolgerung, dass der Totenkopfaffe ein geeignetes Tiermodell darstellt, um Aussagen über die Wirkungen von MDMA im Menschen zu treffen. Im Einzelnen hängt die Aussagekraft dieses Tiermodells jedoch davon ab, welcher pharmakokinetischer Parameter von MDMA oder einem seiner Metaboliten die pharmakodynamische Wirkung, die untersucht werden soll, am stärksten beeinflusst
2009-07-09
2017-07-12T07:26:36Z
2009-07-09
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-22851
hdl:20.500.11880/22649
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22593
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226532019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Enantiomers of methylenedioxy designer drugs : the role of cytochrome P450s and catechol-O-methyltransferase in their metabolism
Enantiomere von Methylendioxy-Designer-Drogen : die Rolle von Cytochrome P450 und Catechol-O-Methyltransferase in ihrem Metabolismus
Meyer, Markus Robert
Maurer, Hans H.
ddc:500
Cytochrome
Drogenmissbrauch
Metabolismus
Catecholmethyltransferase <Catechol-0-Methyltransferase>
Enantiomere
Ecstasy
P450
cytochrome
COMT
metabolism
MDMA
Exstasy
MDA
MDEA
MBDB
enantiomers
In the presented studies, the CYP dependent, enantioselective N-dealkylation and demethylenation of the designer drugs MDMA (Ecstasy), MBDB (Eden), and MDEA (Eve) was investigated. Furthermore, the COMT-catalyzed O-methylation of the supposed neurotoxic catecholic metabolites of the aforementioned drugs and the demethylenation of the dealkyl metabolites MDA and BDB was studied. The data clearly indicated a metabolic preference for the S-enantiomer of all investigated compounds, indicating CYP2C19 to be the most selective in all cases. Furthermore, their N-dealkyl-metabolites MDA, BDB are also demethylenated with a preference for their S-enantiomers. Data also suggest that the primary amines are not metabolized as enantioselectively as the secondary amines. The catecholic phase-I metabolites are also enantioselectively methylated with a preference for their S-enantiomer. These findings explain in part the observed different in vivo kinetic of these methylenedioxy designer drugs. Inhibition studies with the catecholic phase-I metabolites DHMA, DHEA, and DHMBB indicated an uncompetitive inhibition of the sCOMT catalyzed dopamine 3-methylation. This inhibition of the dopamine methylation in the central nervous system could be another reason for the drug-induced irreversible damage to central nerve terminals.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Cytochrom P450 abhängige, enantioselektive N-Desalkylierung und Demethylenierung der Missbrauchsdrogen MDMA, MBDB und MDEA untersucht. Des Weiteren wurden Studien zur COMT-katalysierten O-Methylierung der catecholartigen Phase I Metabolite DHMA, DHEA und DHMBB sowie der Demethylenierung der N-Desalkyl-Metaboliten MDA und BDB angeschlossen. Die erhaltenen Daten dokumentieren eindeutig eine Präferenz für das S-Enantiomer der jeweiligen Stammverbindungen. Das Isoenzym CYP2C19 scheint in diesem Zusammenhang dasjenige Isoenzym mit der größten Enantioselektiviät zu sein. Die N-Desalkyl-Metaboliten der Ausgangsverbindungen wurden ebenfalls enantioselektiv, mit einer S-Präferenz, demethyleniert. Es war jedoch augenfällig, dass die Enantioselektivität bei diesen primären Aminen niedriger zu sein scheint als bei den sekundären Aminen. Auch die catecholartigen Phase I Metabolite der zuvor erwähnten Drogen unterliegen einer die S-Enantiomere bevorzugenden O-Methylierung. Diese Befunde können auch dazu beitragen, die in vivo beobachteten pharmakokinetischen Unterschiede der jeweiligen Enantiomere zu erklären. Abschließend wurden Hemmstudien mit den Metaboliten DHMA, DHEA und DHMBB durchgeführt. Diese zeigten eine nichtkompetetive Hemmung bezüglich der sCOMT-katalysierten 3-O-Methylierung von Dopamin. Diese Hemmung der physiologischen Methylierung könnte mit ein Grund für die beschriebene drogeninduzierte, irreversible Schädigung der Nervenzellendigungen sein.
2009-08-13
2017-07-12T07:26:37Z
2009-08-13
2009
2009-08-13
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-24000
hdl:20.500.11880/22653
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22597
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226552019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Development of a physiology based diffusion model to predict dermal absorption using experimental input parameters
Entwicklung eines Physiologie-basierten Diffusionsmodells zur Vorhersage der dermalen Absorption unter Verwendung experimenteller input-Parameter
Hansen, Steffi
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Hautresorption
Diffusionsmodell
Hornschicht
Lipide
Proteinbindung
Verteilungskoeffizient
Diffusionskoeffizient
skin absorption
diffusion model
cornified protein envelope
partition coefficient
diffusion coefficient
A physiology-based diffusion model is developed to predict drug transport across human skin. It features the "brick-and-mortar';-geometry with homogeneous lipid and corneocyte phases, accessible corneocytes and a homogeneous viable skin layer compartment. Methods are developed to determine all relevant input parameters. Partition and diffusion coefficients are measured using human abdominal skin or are estimated from experimental data, if not directly accessible. Caffeine (CAF) and flufenamic acid (FFA) serve as model drugs. The quality of the model is evaluated by comparing experimental and predicted concentration-depth-profiles. For both CAF and FFA it is found that the corneocytes have a decisive influence on stratum corneum affinity and transport.
Therefore, mechanisms of corneocyte-interactions are investigated experimentally and theoretically for the model drugs CAF, FFA, and testosterone (TST). For the non-protein binding CAF the impact of the aqueous compartment on stratum corneum partitioning is successfully modelled after introducing a bound water fraction that is non-accessible for compound dissolution. For the lipophilic, keratin binding compounds (FFA, TST) interactions are probably confined to the corneocyte surface. Binding to intracellular keratin is limited by their low aqueous solubility.
Ein Physiologie-basiertes Diffusionsmodell zur Vorhersage des Hauttransports wird entwickelt. Die Geometrie basiert auf dem Ziegelstein-Mörtel-Modell, wobei Lipide und Corneocyten sowie die lebenden Hautschichten als homogen und zugänglich für Substanzen angenommen werden. Es werden Methoden entwickelt, um alle relevanten Eingangsparameter für das Modell experimentell zu bestimmen. Verteilungs- und Diffusionskoeffizienten werden an humaner Abdominalhaut gemessen oder, sofern nicht direkt zugänglich, aus experimentellen Daten abgeschätzt. Als Modellsubstanzen dienen Koffein (CAF) und Flufenaminsäure (FFA). Die Modellqualität wird im Vergleich von experimentellen und errechneten Schichttiefenprofilen überprüft. Dies ergab, dass die Corneocyten für sowohl CAF als auch FFA eine entscheidende Rolle bei der Affinität der Substanzen zum stratum corneum sowie bei dem Transport über das stratum corneum spielen.
Daher werden die Mechanismen der Wechselwirkung mit den Corneocyten für die Modellsubstanzen CAF, FFA und Testosteron (TST) experimentell und theoretisch untersucht. Um die Verteilung von CAF, das nicht an Proteine bindet, in das stratum corneum erfolgreich zu modellieren, muss eine gebundene, unzugängliche Wasserphase berücksichtigt werden. Für lipophile, keratinbindende Substanzen (FFA, TST) sind Interaktionen mit den Corneocyten wahrscheinlich begrenzt auf deren Oberfläche. Die Bindung an intrazelluläres Keratin ist aufgrund ihrer geringen Wasserlöslichkeit limitiert.
2009-08-27
2017-07-12T07:26:38Z
2009-08-27
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-24103
hdl:20.500.11880/22655
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22599
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226562019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Herstellung und Charakterisierung mikrostrukturierter Beschichtungen mittels Ink-jet und Pad-printing
Fabrication and characterization of micropatterned coatings using ink-jet and pad-printing
Danzebrink, Rolf
Clasen, Rolf
ddc:500
Sol-Gel-Verfahren
Mikrostruktur
Tintenstrahldruck
Tampondruck
Technische Optik
sol-gel process
microstructured coating
ink-jet printing
pad-printing
optical application
Mikrooptische Systeme erhalten in unserer Zeit eine immer wichtigere Bedeutung. Es müssen dafür die bisherigen Herstellungsmethoden überdacht und nach neuen Prinzipien geforscht werden. Mikrolinsen werden in Detektoren, Glasfaserkupplungen oder auch in der Sensortechnik eingesetzt. In dieser Arbeit wird die prinzipielle Machbarkeit geprüft, Mikrolinsen mit Hilfe eines Tintenstrahl- und Tampondruck- Prozesses herzustellen, indem ein hybrid-organisch-anorganisches Sol auf einem Glassubstrat abgesetzt wird. Viskosität, Lösungsmittelverdunstung, Benetzungseigenschaften und Substrattemperaturen spielen eine große Rolle in der reproduzierbaren Herstellung von Mikrolinsen. Beim Tintenstrahl-Verfahren ist die Herstellung von Einzellinsen und 2D Linsenfeldern aus Solen mit niedrigen Viskositäten möglich. Die Strukturen wurden mittels Profilometrie und Rasterkraftmikroskopie bestimmt. Die optischen Eigenschaften wurden mittels Mikroskopie und spektroskopischen Methoden ermittelt. Die Linsen besitzen Durchmesser von 70 bis 2000 μm, Brennweiten von 165 μm bis 15,8 mm. Das Kapillar (GLT)- Dosiersystem oder das Tampondruck- Verfahren erlaubt z.B. Zylinderlinsen oder größere Linsendimensionen herzustellen.
Microoptics technology is becoming increasingly important in the development of optical systems. Optical components such as diffractive and refractive microlenses are now being incorporated in many systems and commercial products. They are used for example, for focusing in detector array, fiber optics and sensors, for illumination in flat panel displays, computers and for imaging in photocopiers and lithography. Microlenses made of hybrid organic -inorganic materials have been fabricated on glass substrates using commercial drop-on-demand ink-jet printing and pad printing equipments. Viscosity, solvent evaporation, deposit-substrate wetting condition and substrate temperature are the main parameters which govern the obtention of reproducible lens shapes. The shape and surface roughness of the lenses have been characterized by atomic force microscopy and profilometry. Their optical properties have been determined by light microscopy and spectrophotometric techniques. The ink-jet printing technique allows to obtain plano- convex spherical microlenses with diameters varying from 70 to 2000 μm, focal length from 165 μm to 15,8 mm. The capillar —(GLT)- dosing system or the pad printing process also allows to print single and 2-D -arrays of spherical and cylindrical microlenses with somewhat larger dimensions.
2009-09-04
2017-07-12T07:26:38Z
2009-09-04
2006
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-24176
hdl:20.500.11880/22656
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22600
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226572019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Functional applications of Al·Al2O3 nanowires : laser assisted α-Al2O3 synthesis and fabrication of micro-/nanostructured surfaces for cell compatibility studies
Funktionelle Anwendungen von Al·Al2O3-Nanodrähten : laserunterstützte α-Al2O3-Synthese und Fabrikation von mikro-/nanostrukturierten Oberflächen für Zellkompatibilitätsstudien
Aktas, Oral Cenk
Veith, Michael
ddc:500
Nanodraht
Aluminium oxydatum
Biokompatibilität
Laserstrahlsintern
Nanokomposit
laserunterstützte Synthese
Korund
nanowires
nanocomposite
laser treatment
CVD
biocompatibility
Recently, one-dimensional (1D) nanostructures have attracted considerable interest of nanoscience studies as well as nanotechnology applications. Especially 1D hetero-structural nanowires with a combination of two different materials, for instance metal/metal oxide composites, hold a great potential for various photonic and electronic applications. Thus, Al·Al2O3 core-shell nanowires, which were firstly reported by Veith et al., form an interesting class of such hetero-nanostructures.
This thesis describes the preparation of functional surfaces composed of 1D nanostructures by CVD of a (tBuOAlH2)2 [bis(tert-butoxyaluminum dihydride)] precursor and laser treatment of such structures. Firstly, main attention is given to understand the underlying mechanisms controlling the 1D growth of Al·Al2O3 nanostructures. By applying systematically different deposition temperatures and flow rates, various nanostructures were synthesized. At high deposition temperatures chaotic Al·Al2O3 nanowires form, whereas at low deposition temperatures worm- and loop-like nanostructures are achieved. A new mask-less local deposition method, named selective CVD (SCVD), is introduced by selective heating of the substrate with electro magnetic induction. A controlled thermal gradient leads to the observation of stepwise 1D growth of nanostructures. As a continuation the of the local deposition approach,an LCVD system has been designed and fabricated to show the possibility to grow 1D complex structures. α-Al2O3 layers were synthesized by laser induced heating of deposited Al·Al2O3 nanowires. In particular, two laser processing approaches were investigated: continuous wave (CW) laser and pulsed laser treatments. CW laser treatment is useful to produce dense and fully crystalline α-Al2O3 layers which may be employed as hard and protective coatings. Pulsed laser treatment produces a large variety of nanostructures (nanopores, nanoprotrusions, nanospheres etc.) of Al2O3 which is interesting for studying cell-surface interactions.
Micro /nanostructured surfaces prepared by direct deposition of (tBuOAlH2)2 and laser treatment were tested for biocompatibility. Jurkat cells seem to adhere selectively on Al·Al2O3 nanowires which may lead to applications in cancer diagnosis and therapy. Laser treated Al·Al2O3 layers exhibit a better biocompatibility for normal human dermal fibroblast (NHDF) cells. In addition, a preliminary study on neurons showed that Al·Al2O3 nanowires provide enhanced cellular adhesion and growth which can be interesting for various applications in medical fields as well as in biosciences.
In jüngster Zeit konnten eindimensionale (1D) Nanostrukturen beträchtliches Interesse sowohl der Nanowissenschaften als auch der Anwender der Nanotechnologie auf sich ziehen. Insbesondere 1D heterostrukturelle Nanodrähte, kombiniert aus zwei unterschiedlichen Materialien, beispielsweise Metall-Metalloxid-Zusammensetzungen, verfügen über bedeutendes Potential für verschiedenste photonische und elektronische Anwendungen. So bilden die zuerst von Veith et al. beschriebenen Al·Al2O3-Kern-Hülle-Nanodrähte eine Klasse dieser Hetero-Nanostrukturen.
Diese Dissertation behandelt die Herstellung funktionaler 1D-Oberflächen mittels Chemical Vapor Deposition (CVD) mit einem (tBuOAlH2)2-Präkursor und anschließender Laser-Prozessierung. Zunächst gilt das Hauptinteresse dem Verständnis des zugrundeliegenden Mechanismus, der das Wachstum der Al·Al2O3-Nanostrukturen beeinflusst. Durch systematische Verwendung unterschiedlicher Depositionstemperaturen und Präkursorflussraten werden verschiedene Nanostrukturen synthetisiert. Bei hohen Temperaturen bilden sich chaotische, unregelmäßige Al·Al2O3-Nanodrähte, während bei niedrigen Temperaturen wurm und schleifenartige Nanostrukturen erhalten werden. Als eine neue Depositionsmethode, ohne Verwendung einer Maske und durch selektives Erhitzen des Substrats mittels elektromagnetischer Induktion, wird das sogenannte selektive CVD-System (SCVD) eingeführt. Ein kontrollierter Temperaturgradient führt zu der Beobachtung des schrittweisen eindimensionalen Wachstums von Nanostrukturen. Desweiteren wird als Fortsetzung des lokalen Depositionsverfahrens ein Laser-CVD-Verfahren erarbeitet und entwickelt, um die Möglichkeit des Erzeugens komplexer 1D-Strukturen aufzuzeigen.
α-Al2O3-Beschichtungen werden mittels laserinduzierter Erhitzung der Al·Al2O3-Nanodrähte synthetisiert. Im Einzelnen kommen zwei Laser Prozessierungsverfahren zur Anwendung: Continuous-wave(CW)-laser-Behandlung und die Prozessierung mittels gepulstem Laser. Die CW-Laser-Behandlung ist anwendbar für die Herstellung dichter und vollständig kristalliner α-Al2O3-Kompositschichten, die als harte, schützende Beschichtungen Verwendung finden können. Die Behandlung mit einem gepulsten Laser hingegen erzeugt eine große Bandbreite von Nanostrukturen (nanopores, nanoprotrusions, nanospheres etc.) aus Al2O3, die dem Studium von Zell-Oberflächen-Interaktionen dienen können.
Durch direkte (tBuOAlH2)2-Deposition und anschließende Laserbehandlung erzeugte mikro- beziehungsweise nanostrukturierte Oberflächen werden auf ihre Biokompatibilität hin untersucht. Jurkat-Zellen adhärieren selektiv an Al·Al2O3-Nanodrähten, was zu der Verwendung dieser Strukturen in der Diagnose und Therapie von Karzinomerkrankungen führen kann. Laserbehandelte Al·Al2O3-Schichten zeigen eine gute Biokompatibilität für normale Fibroblasten der menschlichen Dermis (normal human dermal fibroblasts, NHDF). Desweiteren zeigen erste Untersuchungen an Neuronen (Nervenzellen), dass Al·Al2O3-Nanodrähte zu gesteigerter Adhäsion und vermehrtem Wachstum dieser Zellen führen, was für verschiedene Anwendungen sowohl im medizinischen Bereich als auch in den Biowissenschaften von Interesse ist.
2009-09-04
2017-07-12T07:26:39Z
2009-09-04
2009
2009-09-04
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-24113
hdl:20.500.11880/22657
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22601
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226592019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Synthese und Untersuchung von Koordinationsverbindungen des cis-Inosit und alkylierter Derivate
Synthesis and examination of coordination compounds of cis-inositol and alkylated derivatives
Kutzky, Barbara
Hegetschweiler, Kaspar
ddc:500
Inosite
Komplexe
Chelatbildner
Kristallstruktur
Polyalkohol
inositol
complex
chelating ligand
crystal structure
polyalcohol
Die Liganden 1,3,5-Tri-O-methyl-cis-inosit (tmci) und 1,3,5-Tri-O-propyl-cis-inosit (tpci) wurden durch selektive Alkylierung von cis-Inosit (ino) hergestellt. Die Konformation von tmci, tpci sowie der Zwischenprodukte der Synthesen wurde in Lösung mittels NMR-Spektroskopie ermittelt. Die Struktur von tmci und einiger Derivate von ino wurden im festen Zustand durch Röntgenstrukturanalyse charakterisiert. Das elektrochemische Verhalten von ino wurde im basischen Milieu mittels Cyclovoltammetrie untersucht.
Es wurden Komplexe von ino mit Al(III), Ga(III), Ge(IV), Sn(IV), Ti(IV), Mn(IV), Ru(IV) Os(IV), Sb(V), Co(II), Ni(II), Pb(II), Mo(VI) und Nb(V) synthetisiert und ihre Festkörperstrukturen aufgeklärt. Mit tmci wurden Verbindungen von Co(II), Pb(II), V(V), Fe(III) und Nd(III) hergestellt und im Festkörper untersucht.
Bis auf wenige Ausnahmen werden die Zentralkationen mit Ionenradien unter 0.8 Å über den triaxialen Modus und größere Kationen bevorzugt über den side-on Modus der Liganden koordiniert.
Die Strukturen von Pb3(inoH-3)2 und K2[Mn(inoH-3)2Mn2(ox)2] zeigen einen supramolekularen Aufbau, im Festkörper von Cs3[Nb4O7(inoH-3)3] bildet sich ein achtkerniger Niob-Cluster.
Das VO2+-tmci System wurde mittels potentiometrischer Titration und Cyclovoltammetrie charakterisiert.
Mit den Seltenerdmetalle Lanthan, Neodym und Europium wurden mehrere kristalline Verbindungen mit ino, tmci und tpci hergestellt und massenspektrometrisch untersucht.
The new ligands 1,3,5-tri-O-methyl-cis-inositol (tmci) and 1,3,5-tri-O-propyl-cis-inositol (tpci) have been synthesized by selective alkylation of cis-inositol (ino). The conformation of the ligands and intermediates in solution were studied by NMR-spectroscopy. The solid state structures of tmci and some ino derivatives were determined by X-ray crystal structure analysis.
Electrochemical examinations of ino were carried out in alkaline solution by cyclovoltammetric measurements.
With the ligand ino, complexes of Al(III), Ga(III), Ge(IV), Sn(IV), Ti(IV), Mn(IV), Ru(IV) Os(IV), Sb(V), Co(II), Ni(II), Pb(II), Mo(VI) and Nb(V) were synthesized and analysed in the solid state. Complexes of tmci with the cations Co(II), Pb(II), V(V), Fe(III) and Nd(III) were prepared and also studied by X-ray crystal structure analysis. Most of the cations with ionic radii less than 0.8 Å prefer binding via the triaxial coordination site, whereas larger cations favor the side-on coordination mode.
The structures of Pb3(inoH-3)2 and K2[Mn(inoH-3)2Mn2(ox)2] exhibit supramolecular assembling; in the solid state the complex Cs3[Nb4O7(inoH-3)3] consists of a octanuclear Niob(V) cluster.
The VO2+-tmci system was studied by potentiometric and cyclovoltammetric methods.
Several compounds of the rare earth metals Lanthanium, Neodym and Europium with ino, tmci and tpci were prepared and analysed by mass spectrometry.
2009-10-16
2017-07-12T07:26:39Z
2009-10-16
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-24552
hdl:20.500.11880/22659
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22603
ger
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Gasdiffusionselektroden für PEM-Brennstoffzellen durch In Situ-Elektrodeposition
Gas diffusion electrodes for PEM-fuel cells via in situ-electrodeposition
Keller, Vivien
Hempelmann, Rolf-Wilhelm
ddc:500
Brennstoffzelle
Galvanische Abscheidung
Katalysator
In Situ-Elektrodeposition
PEMFC
fuel cell
PEMFC
electrodeposition
Kommerziell erhältliche Membranelektrodeneinheiten sind nach wie vor sehr teuer, da sich auf den Gasdiffusionselektroden eine große Menge an Edelmetallkatalysatoren befindet. Dies liegt vor allem daran, dass sich ein erheblicher Teil der Katalysatorpartikel nicht in der so genannten Dreiphasenzone zwischen elektronenleitender Phase, ionenleitender Phase und Reaktand-Phase befindet.
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, Katalysatorschichten mit einem höheren Nutzungsgrad, d.h. mit einem höheren Anteil an Partikeln elektrochemisch herzustellen, die sich in der Dreiphasenzone befinden. Somit kann mit einer geringeren Edelmetallbeladung eine mit kommerziellen Systemen vergleichbare Leistung erreicht werden.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines elektrokombinatorischen Setups, in welchem kombinatorische Elektrosynthese und Elektroanalyse von Platin-Legierungssystemen durchgeführt werden kann. Damit wurden verschiedene Legierungen kombinatorisch auf ihre Eigenschaften als Katalysatoren für die Elektroreduktion von Sauerstoff, sowie für die Elektrooxidation von Wasserstoff, Methanol und Ethanol hin untersucht.
Commercial available membrane electrode assemblies are still very expensive, since a high noble metal catalyst loading has to be on the gas diffusion electrodes. The reason is particulary the fact that a high amount of the catalyst particles is not located in the so called three phase zone between ion conducting, electron conducting and reactand phase.
In the present work the electrochemical synthesis of catalyst layers with a higher catatalyst utilization, i. e. with a higher amount of particles located in the three phase zone has succeeded. Thus gas diffusion electrodes comparable in performance with commercial materials but coated with a lower catalyst loading were obtained.
A second objective in this work was the development of an electrocombinatoric setup in which both the combinatoric electrosynthesis as well as the combinatoric analysis of platinum and platinum alloys can be performed. Furthermore different alloys were electrodeposited and electrocombinatorically analyzed with respect to their catalytic activity in the electroreduction of oxygen and the electrooxidation of hydrogen, methanol and ethanol.
2009-10-19
2017-07-12T07:26:39Z
2009-10-19
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-24402
hdl:20.500.11880/22660
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22604
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226612019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Synthesis, crystal structure and physico-chemical studies on thienyl-substituted alkoxides of the rare earth metals
Synthesen, Kristallstrukturen und physikalisch-chemische Untersuchungen von Thienyl-substituierten Alkoxiden der seltenen Erdmetalle
Belot, Céline
Veith, Michael
ddc:500
Lanthanoide
Alkoholate
Elektrochemie
Lumineszenz
lanthanide
alkoxide
electrochemistry
luminescence
The present work focuses on the synthesis, crystal structure determination, electrochemical and luminescence studies of thienyl-substituted methoxides of alkali, tin(II) and rare earth metals. The first part is devoted to the synthesis, NMR and crystallographic investigations of the new products. To correlate structural and stereoelectronic effects on the molecular geometry, a series of rare earth metal alkoxides was prepared. The second part deals on the electrochemical properties of the novel compounds. The cyclic voltammograms are dominated by the oxidation wave of the thiophene groups. No reduction or oxidation of the metal centres has been noticed. Contrarily to the other compounds, the repetitive cycling of potentials of HO—C(C8H5S2)3 (1), {Nd[OC(C8H5S2)3]3(thf)3} • 4 thf (10) and Er[OC(C8H5S2)3]3(thf) (11) leads to the formation of electroactive polymeric film. The third part concerns the luminescence properties of the novel compounds. The UV-Vis absorption spectra are dominated by the organic ligands. The emission spectra of the potassium, sodium and yttrium compounds reveal broad bands attributed to the Pi*-Pi transitions of the aromatic ligands. Furthermore, the luminescence spectra of the Nd3+ and Sm3+ alkoxides exhibit an energy transfer ("antenna effect';) from the ligand to the lanthanide centre.
Die vorliegende Dissertationschrift behandelt die Synthese, kristallographische Charakterisierung, sowie elektrochemische als auch photophysikalische Untersuchung von Thiophene-substituierten Methoxiden der Alkalimetalle, Sn(II) und Selten Erden. Der erste Teil ist der Synthese, NMR- sowie der Kristallstruktur-Untersuchung der neuen Verbindungen gewidmet. Um strukturelle und stereoelektronische Effekt bezüglich der Molekülgeometrie miteinander korrelieren zu können, wurde eine ausgedehnte Serie von Metall-Alkoxiden dargestellt. Der zweite Teil umfasst die elektrochemischen Eigenschaften der neuen Verbindungen. Die zyklischen Voltamogramme werden durch die Oxidationwelle der Thiophengruppen bestimmt. Jedoch lässt sich weder eine Reduktion noch Oxidation der Metallzentren nachweisen. Im Gegensatz zu den anderen Verbindungen führt das wiederholte Durchlaufen der Redoxpotentiale von HO—C(C8H5S2)3 (1), {Nd[OC(C8H5S2)3]3(thf)3} • 4 thf (10) und Er[OC(C8H5S2)3]3(thf) (11) zur Ausbildung von Polymerfilmen. Der dritte Teil beschreibt die Lumineszenz-Eigenschaften der neuen Verbindungen. Die UV-Vis Absorptionsspektren werden von den organischen Liganden dominiert. Die Emissionsspektren der Natrium, Kalium und Yttrium-Verbindungen zeigen breite Banden, welche den Pi*-Pi Übergängen der aromatischen Liganden zugeordnet werden. Zudem belegen die Lumineszenzspektren der Nd3+ und Sm3+ Alkoxide einen Energietransfer ("Antenneneffekt") vom Liganden hin zum Lanthanid-Zentrum.
2009-10-27
2017-07-12T07:26:40Z
2009-10-27
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-24521
hdl:20.500.11880/22661
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22605
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226682019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Free energy prediction of biomolecular systems using ensembles of structures
Vorhersage der freien Energien von biomolekularen Systemen unter Verwendung von Strukturensembles
Benedix, Alexander
Santen, Ludger
ddc:500
Freie Energie
Molekulardynamik
Proteinfaltung
Proteinbindung
Insulin
Protein p53
Lactamase <beta->
Poisson-Boltzmann Gleichung
Generalized Born
free energy prediction
molecular dynamics
protein folding
protein binding
Knowledge about the underlying free energy landscape of biomolecules is crucial for a basic understanding of the inner workings of proteins. Its fast and accurate calculation is indispensable for conformational analysis, structure-based protein design or for protein docking. On the one hand, existing rigorous methods like free energy perturbation or thermodynamic integration are time-consuming and cannot be used for large scans required for protein or vaccine design. On the other hand, fast treatments rely on empirical or statistical data and deliberately neglect protein flexibility and are therefore limited in accuracy.
In this thesis, a novel method for the estimation of free energy changes upon mutation is proposed combining a physical effective energy function with an efficient sampling of available conformational space. The energy function is based on physical chemistry and an efficient continuum solvent approach. It is averaged over alternative protein conformations fulfilling geometric constraints. The main advantage of our method is its inclusion of full protein flexibility, which dramatically improves the prediction quality for protein-protein binding affinities. Due to its hundredfold gain in speed with respect to conventional methods the method enables e.g. full mutant scanning of protein-protein interfaces.
The method was successfully applied to the study of mutational effects on protein-protein and protein-peptide binding.
Die Kenntnis der Freie-Energielandschaft von Proteinen ist essentiell für ein tiefergehendes Verständnis ihrer Funktionsweise. Die schnelle und präzise Bestimmung der Freien Energie ist wichtig für strukturbasierte Analysen, Proteindesign oder für das Proteindocking. Methoden wie die Freie Energie Störungsrechnung liefern physikalisch korrekte Beschreibungen, die allerdings mit hohem Rechenaufwand verbunden sind und daher für umfängliche Untersuchungen ungeeignet sind. Schnelle Methoden stützen sich dagegen auf empirische oder statistische Daten, vernachlässigen dabei die Proteinflexibilität und weisen daher eine eingeschränkte Genauigkeit auf.
Diese Arbeit stellt eine neu entwickelte Methode zur Berechnung von Freien Energieänderungen durch Mutationen vor, die eine physikalisch effektive Energiefunktion mit einer effizienten Abtastung des verfügbaren Konformationsraumes kombiniert.
Die über alternative Proteinstrukturen gemittelte Energiefunktion basiert auf physikalischer Chemie und einer effizienten Behandlung des Lösungsmittels. Der größte Vorteil unserer Methode ist die Berücksichtigung der vollen Flexibilität, welche die Vorhersagequalität von Bindungsaffinitäten deutlich steigert. Durch einen hundertfachen Geschwindigkeitszuwachs im Vergleich zu konventionellen Methoden werden Studien ermöglicht, die den vollen Mutationsraum von Protein-Protein Grenzflächen abdecken.
Die Methode wurde erfolgreich angewandt zur Analyse der Protein-Protein sowie der Protein-Peptid Bindung.
2009-11-06
2017-07-12T07:26:42Z
2009-11-06
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-25404
hdl:20.500.11880/22668
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22612
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226692019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
3D magnetic resonance microscopy of dehydrated biological specimens
3D-Magnetresonanz-Mikroskopie dehydrierter biologischer Materialien
Mietchen, Daniel
Fuhr, Günter R.
ddc:500
NMR-Tomographie
Magnetresonanzmikroskopie
Fossil
Paläontologie
Magnetfeldeffekt
Zellteilung
Kryobiologie
magnetic resonance imaging
magnetic resonance microscopy
fossils
palaeontology
cell division
cryobiology
Objectives: The major theme of this thesis is the evaluation of the potential of Magnetic Resonance Microscopy (MRM) for branches of the life sciences that have previously seen few or no applications of this non-invasive methodology, particularly for cell biology, palaeontology and cryobiotechnology. An emphasis will be put on the role of liquid water whose multiple biological functions — as a solvent, structural element and metabolite — render it essential for life as we know it.
Background: Dehydration beyond a critical threshold poses a serious threat to most organisms in their active state, and mechanisms helping to cope with draught stress present an evolutionary advantage in environments lacking permanent access to liquid water. From a biotechnological point of view, mastering the reversible transition between hydrated and dehydrated states of biological material would allow their long-term storage and facilitate a continuous supply, especially in cases where cell and tissue culture are impossible or not desirable. One of the ways to achieve this is cryopreservation, an arsenal of methods designed to store biological materials for long terms at biologically low temperatures to minimise degradation. In recent years, a trend has developed towards freezing of small cell clusters or even single cells, as opposed to large chunks of tissue. This creates an increased demand for miniaturised cryopreservation systems, and the reduced amount of material raises the need for high-resolution non-invasive supervision of the cryoprocessing.
Method: Magnetic Resonance (MR) techniques have become famous precisely for their non-invasiveness and their sensitivity to liquid water, yet microscopic MR applications to dehydrated samples have been scarce, mainly because (i) the signal-to-noise ratio decreases upon dehydration — even dramatically so upon freezing — and (ii) high spatial resolutions translate into a considerable reduction of the already low signal intensity. The primary goals of this study were, therefore, to determine whether these two major barriers can be overcome individually as well as in combination and to evaluate whether the strong magnetic fields necessary for such experiments could interfer with cellular physiology.
Results: Microscopic MR image series allowed the non-invasive assessment of the morphology within a well-hydrated cell biological model system (oocytes and embryos of the frog Xenopus laevis), in extreme examples of long-term preservation and dehydration (fossil remains of invertebrate, vertebrate and plant species) and in cryobiological samples ranging from tumor cell spheroids to larvae of cold-hardy insects. Cell division and embryogenesis could be observed in MRM images of Xenopus embryos, and spatially localised MR spectra from subcellular compartments delivered biochemical information about Xenopus oocytes in their normal state and upon uptake of an externally applied drug. A previously described apparent magnetic field effect on Xenopus embryos could be shown not to depend on the magnetic field, as opposed to a new effect found in oocytes artificially deprived of their jelly coat. MRM data allowed the diagnosis of pathological alterations in fossils and the monitoring of cryoprotectant effects in frozen or supercooled insects.
Conclusions: These experiments demonstrate that, from a technical perspective,MRM indeed has the potential to become a tool for cell biology, palaeontology as well as cryobiotechnology and that side effects of the methodology, though detectable under unphysiological conditions, do not prevent that.
Zielsetzung: Hauptthema dieser Dissertation ist die Auslotung der Analysemöglichkeiten, welche die Magnetresonanzmikroskopie (MRM) in Bereichen der Lebenswissenschaften bietet, die bisher keine oder wenige Anwendungen dieser nicht-invasiven Methodik erfahren haben, insbesondere Zellbiologie, Paläontologie und Kryobiotechnologie. Ein Schwerpunkt wird auf die Rolle flüssigen Wassers gelegt, das aufgrund seiner vielfältigen biologischen Funktionen — als Lösungsmittel, Struktur- und Stoffwechselelement — eine der wichtigsten Grundvoraussetzungen für Leben darstellt.
Hintergrund: Dehydrierung über ein bestimmtes Maß hinaus birgt für die aktiven Stadien der meisten Organismen eine ernste Gefahr. Demzufolge stellen Mechanismen zur Bewältigung von Wassermangel einen deutlichen evolutionären Vorteil in einer Umgebung dar, wo permanenter Zugang zu flüssigem Wasser fehlt. Aus biotechnologischer Sicht ist die Beherrschung eines reversiblen Überganges biologischer Materialien vom hydrierten in den dehydrierten Zustand von Interesse, würde dies doch deren Langzeitaufbewahrung und eine prinzipiell permanente Verfügbarkeit ermöglichen, besonders in Fällen, in denen Zell- und Gewebekultur unmöglich oder nicht erwünscht sind. Dieses Ziel kann auf unterschiedlichen Wegen erreicht werden. Einer davon ist die Kryokonservierung — ein Arsenal von Methoden, welche darauf abzielen, biologisches Material langfristig bei biologisch tiefen Temperaturen zu lagern, wodurch Stoffwechselprozesse sehr stark verlangsamt werden oder ganz zum Erliegen kommen. Gegenwärtig gibt es einen Trend weg vom Einfrieren großer Gewebestücke und hin zu kleinen Zellhaufen oder sogar einzelnen Zellen. Damit einher geht eine zunehmende Nachfrage nach miniaturisierten Kryokonservierungssystemen, und der verringerte Umfang einzelner Gefrierproben verlangt zudem nach einer hochauflösenden und zunehmend nicht-invasiven Überwachung der Kryoprozessierung.
Methode: Kernspin- bzw. Magnetresonanztechniken (MR) verdanken ihre Popularität vor allem ihrer nicht-invasiven Natur und ihrer Empfindlichkeit gegenüber flüssigem Wasser, jedoch blieben mikroskopische Anwendungen dieser Technik an dehydrierten Proben bisher rar. Die Hauptgründe dafür sind, dass (i) das Signal-Rausch-Verhältnis mit der Dehydrierung abnimmt — beim Gefrieren sogar dramatisch — und (ii) die geforderte hohe räumliche Auflösung eine beträchtlichen Verringerung der ohnehin geringen Signalintensität bedeutet. Das erste Ziel der vorliegenden Studie war daher festzustellen, ob diese zwei grundlegenden Hindernisse zunächst einzeln, aber auch in Kombination überwunden werden können und abzuschätzen, inwiefern die starken magnetischen Felder, die für solche Experimente nötig sind, die zelluläre Physiologie beeinflussen könnten.
Ergebnisse: Anhand mikroskopischer MR-Bildreihen konnte die interne Morphologie eines wasserreichen zell- und entwicklungsbiologischen Modellsystems (Oozyten und Embryos des Frosches Xenopus laevis) nicht-invasiv bestimmt werden. Dies gelang ebenso in extrem langzeitkonservierten wasserarmen Proben (Fossilien vonWirbellosen,Wirbeltieren und Pflanzen) wie in kryobiologischen Systemen, die von Tumorzell-Sphäroiden bis zu Larven kälteresistenter Insekten reichten. Zellteilung und Embryogenese konnten mit MRM-Bildserien sich entwickelnder Xenopus-Embryonen verfolgt werden, und ortsspezifische MR-Spektren von subzellulären Kompartimenten lieferten biochemische Informationen über Xenopus-Oozyten unter physiologischen Bedingungen sowie nach Verabreichung einer pharmakologischen Testsubstanz. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass ein zuvor beschriebener scheinbarer Magnetfeldeffekt auf Xenopus-Embryonen ganz unabhängig vom Magnetfeld auftritt und vielmehr auf die künstliche Entfernung der Gallerthülle, welche Amphibien-Eier umgibt, zurückzuführen ist, während in unbefruchteten Eizellen — ohne Gallerthülle — tatsächlich eine magnetfeldinduzierte Pigmentverschiebung beobachtet werden kann. Des Weiteren lieferten MRM-Daten pathologische Befunde aus dem Inneren intakter Fossilien und umfassende Einsichten in Gefrierschutzmechanismen gefrorener sowie unterkühlter Insektenlarven.
Schlussfolgerungen: Diese Experimente zeigen, dass MRM vielfältig als analytische, diagnostische oder Prozesskontrolltechnik in Zellbiologie, Paläontologie und Kryobiotechnologie angewendet werden kann und dass nachweisbare, jedoch nur unter nichtphysiologischen Bedingungen auftretende methodenbedingte Nebenwirkungen dem nicht im Wege stehen.
2009-11-16
2017-07-12T07:26:44Z
2009-11-16
2006
2010-07-14
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-24161
hdl:20.500.11880/22669
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22613
ger
openAccess
cc_by
https://creativecommons.org/licenses/by/2.0/
oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226702019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Entwicklung eines Screeningsystems zur Identifizierung hochaktiver und selektiver Hemmstoffe der 17beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 1 (17betaHSD1)
Development of a screening system for the identification of highly active and selective inhibitors of 17beta-hydroxysteroid-dehydrogenase type 1 (17betaHSD1)
Kruchten, Patricia
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Enzym
Enzyminhibitor
Brustkrebs
Endometriose
Estradiol
Estradiolstoffwechsel
Screening
estrogenabhängige Erkrankungen
nichtsteroidale Inhibitoren
estrogen dependent diseases
non-steroidal inhibitors
screening system
Im Rahmen der Entwicklung selektiver Inhibitoren der 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 1, wurde ein komplexes Screeningsystem aufgebaut, welches sich zur Selektion vielversprechender Verbindungen sowie zur Ableitung von Struktur-Wirkungsbeziehungen eignet. Dadurch wurden zwei Leitstrukturen gefunden und hinsichtlich Selektivität und Pharmakokinetik optimiert. Die sequentielle Kombination der einzelnen Tests führte zur rationellen Identifizierung von Verbindungen, deren Eigenschaften einen Versuch zur Targetvalidierung erlauben.
Deshalb wurden Aktivität und Selektivität ausgewählter Verbindungen am Rattenenzym evaluiert. Dazu wurden Leberpräparationen auf ihre altersabhängige Fähigkeit hin untersucht, E1 und E2 ineinander umzuwandeln. Es wurde eine signifikante Abnahme der E2-Produktion mit steigendem Alter festgestellt. Die Präparationen wurden zur Etablierung zweier Tests auf Inhibtion der Estrogenkonversion genutzt, durch welche Hemmstoffe der E2-Produktion identifiziert wurden.
In einem Zellkulturversuch wurden selektierte Verbindungen auf ihre Fähigkeit zur Modulierung der estrogenabhängigen Proliferation hin untersucht. Die gefundene, selektive Inhibition der durch E1 stimulierten Proliferation bei gleichzeitig unbeeinflusstem, E2-induzierten Wachstum untermauert den Ansatz der 17βHSD1-Inhibiton zur Therapie des Mammakarzinoms. Damit wurden eine erste Targetvalidierung erbracht, wirksame Inhibitoren identifiziert und die Effizienz des Screeningsystems gezeigt.
A complex screening system was developed for the identification and optimisation of selective 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase type 1 inhibitors. Compounds were designed, synthesised, and after testing active structures were identified. Elucidation of the structure-activity-relationships resulted in the identification of two lead structures which were further optimised. The rational combination and sequential application of the single tests led to an efficient identification of compounds suitable for target validation.
Persuing this issue, activity and selectivity evaluation in rats were performed. Therefore, the age dependent ability of rat liver preparations to convert E1 into E2 or vice versa was investigated. E2-production was found to be reduced in the aged rats. Having shown both activities the liver preparations were used for the development of two inhibition tests. Applying these assays active inhibitors of E2-production were identified.
For target validation, inhibitors selected in the screening assay were investigated in a cell culture experiment. Their ability to modulate estrogen-dependent growth was shown. E1-induced proliferation was selectively reduced by simultaneous inhibitor-addition. In contrast, E2-mediated growth was not affected. This supports the approach of 17βHSD1-inhibition as therapy option for breast cancer. Thus, a first target validation was performed, effective inhibitors were identified and the efficiency of the screening system was shown.
2009-11-17
2017-07-12T07:26:44Z
2009-11-17
2009
2009-11-17
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-25666
hdl:20.500.11880/22670
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22614
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226712019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Heme-iron complexing biphenyl and naphthalene derivatives as CYP17 inhibitorsfor the treatment of prostate cancer : design, synthesis and evaluation
Häm-Eisen komplexierende Biphenyle und Naphthalinderivate als CYP17 Hemmstoffe für die Behandlung von Prostatakrebs : Design, Synthese und Evaluierung
Pinto-Bazurco Mendieta, Mariano Aurelio Ernesto
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Pharmazie
Prostata
Krebsforschung
CYP17
Prostata
Krebs
Design
Synthese
CYP17
prostate
cancer
design
synthesis
Insufficient efficacy and unsafe treatment options are the current state of the art of prostate cancer therapies. This motivated us to develop antiandrogenic drugs with reduced side effects, aiming at effective tumor growth prevention and regression for prostatic adenocarcinomas. The key enzyme in androgen synthesis CYP17 is to date the most promising target for an overall, mild treatment of prostate carcinomas. Thus, it was our aim to develop nonsteroidal CYP17 inhibitors. In the present work, the synthesis, biological evaluation and molecular modeling studies of 69 compounds divided in three main classes are presented. These were published in three different international scientific magazines. A further manuscript is already prepared. Other related compounds, not essential for this work, are already published or to be published soon in four other co-authored works.
Ungenügend wirksame und risikoreiche Behandlungen sind der heutige Stand der Prostatakrebstherapien. Dies motivierte uns zur Entwicklung antiandrogener nebenwirkungs-armer Wirkstoffe mit dem Ziel eine effektive Tumorwachstumprävention und -regression prostatischer Adenokarzinome zu erreichen. Das Schlüsselenzym der Androgensynthese CYP17 ist bis dato das vielversprechendste Target für eine Behandlung des Prostatakarzinoms. Dementsprechend war es unser Ziel nichtsteroidale CYP17 Inhibitoren zu entwickeln. In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese, biologische Evaluierung und Molecular Modeling Studien von 69 Verbindungen in drei Substanzklassen vorgestellt. Diese wurden in drei verschiedenen internationalen Zeitschriften publiziert. Ein weiteres Manuskript ist fertiggestellt. Andere verwandte, für diese Arbeit nicht essentielle Verbindungen, sind in vier weiteren Publikationen niedergelegt.
2009-11-30
2017-07-12T07:26:44Z
2009-11-30
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-21476
hdl:20.500.11880/22671
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22615
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226782019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Isolation and identification of natural products and biosynthetic pathways from Photorhabdus and Xenorhabdus
Isolierung und Untersuchung von Naturstoffen und Biosynthesewegen aus Photorhabdus und Xenorhabdus
Brachmann, Alexander Oliver
Bode, Helge B.
ddc:500
Biosynthese
Xenorhabdus
Sekundärmetabolit
Stilbenderivate
Anthrachinonderivate
Photorhabdus
Naturstoffe
Entomopathogen
Photorhabdus
Xenorhabdus
natural products
biosynthesis
stilbenes
The entomopathogenic bacteria of the genera Photorhabdus and Xenorhabdus display perfect model organisms to gain insights into the sophisticated interplay between symbiosis and pathogenicity. Moreover, numerous publications in the last years have demonstrated that these bacteria represent a rich source of secondary metabolites, which is exemplified in this work with the description of the novel xenofuranone compounds. The recently available genome sequence of Photorhabdus luminescens TT01 pointed out that many biosynthetic gene clusters remain silent as the corresponding product cannot be detected. The heterologous expression of a nonribosomal peptide synthetase, which resulted in the successful production of indigoidine, depicts one way to gain access on these cryptic gene clusters. In addition the genome sequence also enabled the identification of biosynthesis genes of the already known compound families of stilbenes and anthraquinones. Thereby a type II polyketide synthase cluster was identified, which is responsible for anthraquinone biosynthesis, representing only the second known type II PKS derived compound from a Gram-negative bacterium. Furthermore the identification of genes involved in stilbene biosynthesis led to the discovery of a unique and novel pathway, strongly differing from plant derived stilbenes.
Entomopathogene Bakterien der Gattungen Photorhabdus und Xenorhabdus eignen sich hervorragend als Modelorganismen um Einblicke in das komplizierte Wechselspiel zwischen Symbiose und Pathogenität zu erhalten. Darüber hinaus haben zahlreiche Publikationen der letzten Jahre gezeigt, dass diese Bakterien eine reiche Quelle an Sekundärstoffen darstellen. In der vorliegenden Arbeit wird dies anhand der neu beschriebenen Xenofuranone verdeutlicht. Die veröffentlichte Genomsequenz von Photorhabdus luminescens TT01 offenbarte, dass die meisten Biosynthese Gencluster "verwaist" sind, das heißt es ließ sich bisher kein dazugehöriges Produkt detektieren. Die erfolgreiche heterologe Expression einer nichtribosomalen Peptidsynthetase und der damit verbundenen Produktion von Indigoidin, zeigte eine Möglichkeit auf um Zugang zu solchen "verwaisten" Genclustern zu erhalten. Des Weiteren erlaubte die Genomsequenz nach Biosynthesegenen zu suchen, deren Produkte wie zum Beispiel die Stilbene oder die Anthrachinone bereits bekannt waren. Auf diese Weise konnte ein Typ II Polyketidsynthasecluster der für die Biosynthese der Anthrachinone verantwortlich ist identifiziert werden. Die Anthrachinone sind damit erst das zweite bekannte Beispiel eines Typ II PKS erzeugten Produktes aus einem Gram-negativen Bakterium. Zusätzlich gelang es die Gene, die an der Stilbenbiosynthese beteiligt sind zu identifizieren und damit einen neuen und einzigartigen Stoffwechselweg, welcher stark abweichend zur pflanzlichen Biosynthese funktioniert zu beschreiben.
2010-01-06
2017-07-12T07:26:46Z
2010-01-06
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-26969
hdl:20.500.11880/22678
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22622
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226792019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Expression der Galaktitol-Dehydrogenase in Rhodobacter sphaeroides D und Herstellung von aktiven Mutationen zur Immobilisierung auf Goldelektroden
Expression of galactitol dehydrogenase in Rhodobacter sphaeroides D and production of active mutations for immobilization on gold electrods
Kornberger, Petra
Giffhorn, Friedrich
ddc:500
Immobilisiertes Enzym
Genregulation
Rhodobacter sphaeroides
Galaktitol-Dehydrogenase
galactitol dehydrogenase
Rhodobacter sphaeroides
immobilization
gene regulation
Die konstitutive Expression der Galaktitol-Dehydrogenase in der gain of function Mutante Rhodobacter sphaeroides D ist auf eine Sequenzverdopplung von 21 Nukleotiden upstream vom Gen zurückzuführen, was als Effekt die Bindung eines GntR-Regulatorproteins als Repressor verhindern oder die Einführung einer neuen Promotorsequenz erlauben würde. Die Untersuchungen zeigen, dass mit hoher Wahrscheinlichkeit der neue Promotor für die Transkription verantwortlich ist. Die Strukturrelevanz von Mg2+-Ionen für die Bildung katalytisch aktiver GatDH-Tetramere konnte durch eine Variante nachgewiesen werden, die C-terminal um die drei Mg2+ komplexierenden Aminosäuren verkürzt war. Die Variante zeigte keine Aktivität mehr und neigte bei der Anreicherung zur Aggregatbildung, was eine ungeordnete Zusammenlagerung der Monomere belegt und eine strukturelle Untersuchung verhinderte. Zur gerichteten Immobilisierung an Goldelektroden wurde die GatDH mit einem N-terminalen Cystein-Tag versehen. Diese Variante wurde mit einer Ausbeute von über 4400 U/l exprimiert und bis zu einer Reinheit von 12,2 U/mg angereichert. Eine SPRMessung bewies die feste Bindung des Enzyms an die Goldoberfläche als Monolayer und CV-Messungen belegten katalytische Aktivität. Diese neuartige Enzymimmobilisierung ist die Grundlage für die Entwicklung eines Enzymreaktors mit elektrochemischer Cofaktor Regenerierung zur enantiomerenreinen Feinchemikalien-Herstellung mit immobilisierten Enzymen, Cofaktoren und Mediatoren.
A 21 nucleotide duplication sequence upstream of the gene is responsible for the constitutive expression of galactitol dehydrogenase in the gain of function mutant Rhodobacter sphaeroides D which could either hamper the binding of a GntR-repressor protein or allow the insertion of a new promoter sequence. Investigations show with high plausibility that the new promoter is responsible for the transcription. The structure relevance of Mg2+-ions for the formation of catalytically active GatDHtetramers could be demonstrated by a variant where the three C-terminal Mg2+ binding amino acids were removed. The variant was no longer active and showed a high tendency to accumulate during purification. Hence, a disordered clustering of the monomers was demonstrated and structural investigations were hampered. For a directed immobilization on gold electrodes the GatDH-enzyme was supplied with an N-terminal cysteine-tag. The variant was expressed with an activity yield of about 4400 U/l and purified to a specific activity of 12,2 U/mg. SPR-measurement confirmed the covalent binding of the enzyme to the gold surface as a monolayer and CV-measurements proofed the catalytic activity. This new principle of enzyme immobilization provides a basis for the development of an enzymatic bioreactor with electrochemical cofactor regeneration for the production of enantiopure fine chemicals with immobilized enzymes, cofactors and mediators.
2010-01-07
2017-07-12T07:26:46Z
2010-01-07
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-26952
hdl:20.500.11880/22679
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22623
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/226992019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Site-directed mutagenesis of the steroid-15beta-hydroxylase (CYP106A2) from Bacillus megaterium ATCC 13368 to alter the regio-selectivity of progesterone hydroxylation
Ortsgerichtete Mutagenese der Steroid-15beta-Hydroxylase (CYP106A2) aus Bacillus megaterium ATCC 13368 zur Änderung der Regioselektivität der Progesteronhydroxylierung
Nguyen, Kim Thoa
Bernhardt, Rita
ddc:500
Ortspezifische Mutagenese
Cytochrom P-450
Bacillus megaterium
Progesteron
Hydroxylierung
CYP106A2
15ß-hydroxylase
Site-directed mutagenesis
CYP106A2
15ß-hydroxylase
CYP106A2 is known as 15b-hydroxylase, but also shows 11a-hydroxylase activity for progesterone, an important pharmaceutical compound. This work focused on the production of a regio-selective hydroxy derivative of progesterone at the C-11 position using site directed mutagenesis of CYP106A2. Based on the docked progesterone-CYP106A2 model, a saturation mutagenesis library (13100 transformants) at positions A395 and G397 had been created to verify the effect of these residues on the regio-selective hydroxylation. Forty of these transformants were randomly selected and screened for higher 11a-hydroxyprogesterone production. Mutants A395I and A395W/G397K showed the highest 11a-hydroxyprogesterone production (19.5 and 56.4-fold, respectively) despite a lower catalytic activity as compared with the WT. Therefore, these mutants were further mutated to improve their catalytic efficiency. Eight new mutants were found to have a higher turnover rate along with an improved 11a-hydroxyprogesterone production. Mutants A106T/A395I and T89N/A395I showed the highest amounts of 11a-hydroxyprogesterone, 2.8- and 4.4-fold increased, respectively, compared with the parent mutants, and 54.9- and 85.2-fold, respectively, compared with the WT. Interestingly, the in vivo conversion of progesterone with the mutant T89N/A395I nearly produced the 11a-hydroxyprogesterone. Since the 11a-hydroxyprogesterone exhibits an antiandrogeneic activity and plays a role in the regulation of the blood pressure, the mutant has a potential scope as biocatalyst.
CYP106A2 ist als 15b-Hydroxylase bekannt, zeigt aber auch 11a-Hydroxylase Aktivität für Progesteron. Ziel dieser Arbeit war die Produktion regio-selektiver Hydroxyderivaten des Progesterones an Position C-11 mittels zielgerichteter Mutagenese am CYP106A2. Eine 13100 Transformanten umfassende Mutantenbank, hergestellt mittels Sättigungsmutagenese, ausgehend von einem mit Progesteron gedockten Modell, diente als Grundlage. Zur Untersuchung des Einflusses der Aminosäuren auf die Regio-selektivität wurden 40 Transformanten zufällig ausgewählt und auf eine höhere 11a-Hydroxyhydroxylierung gescreent. Die Mutanten A395I und A395W/G397K zeigten, verglichen mit dem WT, die höchste 11a-Hydroxyprogesterone Produktion (19,5- bzw. 56,4-fach), trotz geringerer katalytischer Aktivität. Diese Mutanten wurden nochmals mutiert, um die katalytische Effizienz zu erhöhen. Acht neue Mutanten mit einer höheren Umsatzrate und verbesserter 11a-Hydroxyprogesterone Produktion wurden gefunden. Die Mutanten A106T/A395I und T89N/A395I bildeten 2,8- bzw. 4,4-mal mehr 11a-Hydroxyprogesteron als die jeweilige Ausgangsmutante und sogar 54,9- bzw. 85,2-mal mehr als der WT. Interessanterweise hydroxylierte die Mutante T89N/A395I während des in vivo Umsatzes Progesteron fast ausschließlich an der 11a-Position. Da 11a-Hydroxyprogesteron eine antiandrogene Aktivität zeigt und eine Rolle bei der Regulierung des Blutdrucks spielt, ist zu sagen, diese Mutanten einem großer Erfolg und eine gute Vorraussetzung zur biotechnologischen Anwendung ist.
2010-06-08
2017-07-12T07:26:52Z
2010-06-08
2010
2012-06-05
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-31494
hdl:20.500.11880/22699
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22643
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227002019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Studies on the biosynthesis of complex natural products from myxobacteria
Untersuchungen zur Biosynthese komplexer Naturstoffe aus Myxobakterien
Buntin, Kathrin
Müller, Rolf
ddc:500
Biosynthese
Myxobakterien
Polyketid-Synthasen
Naturstoffe
nichtribosomale Peptidsynthetasen
biosynthesis
natural products
myxobacteria
PKS
NRPS
Many myxobacterial natural products display unusual structural features and/or a novel bioactivity, making these secondary metabolites attractive targets for study. This thesis describes the elucidation of the biosynthetic pathways to the ajudazols and thuggacins in Chondromyces crocatus Cm c5 and the thuggacins in Sorangium cellulosum So ce895. Using experiments in vitro and in vivo, we have shown that the thioesterase (TE) domain of the ajudazol assembly line "chaperones'; the formation of the characteristic isochromanone ring, thus placing it within a novel class of TE enzymes. In addition, we have demonstrated the involvement of two P450 enzymes in post-assembly line modification of ajudazol.
Distinct variants of the anti-tuberculosis macrolide thuggacins are produced by C. crocatus and S.cellulosum. The basis for this architectural diversity has been elucidated by identifying the biosynthetic pathways in both myxobacteria, and comparing them in detail. In the course of this analysis, a crotonyl-CoA reductase/carboxylase homologue was discovered in the S. cellulosum thuggacin gene cluster, and was shown to participate in the assembly of an unusual hexyl side chain. Moreover, evidence was provided that the distinct pattern of hydroxylation observed in the C. crocatus and S. cellulosum thuggacins may results from variable action of a conserved FMN-dependent monooxygenase.
Finally, we report experiments to probe the formation of the pyrrole starter unit in leupyrrin biosynthesis in Sorangium cellulosum So ce690, and the biochemical investigation of the mechanism by which the disorazol dilactone structure is generated in Sorangium cellulosum So ce12.
Viele myxobakterielle Naturstoffe haben strukturelle Besonderheiten und/oder weisen eine neuartige biologische Aktivität auf. Im Rahmen dieser Arbeit wurde unter anderem die Biosynthese von Ajudazol und Thuggacin in Chondromyces crocatus Cm c5 und von Thuggacin in Sorangium cellulosum So ce 895 aufgeklärt. Für die Biosynthese von Ajudazol konnte gezeigt werden, dass die Thioesterase (TE) Domäne am Ende des Multienzymkomplexes die Bildung des Isochromanonrings unterstützt und auf Grund der katalysierten Reaktion eine neue Klasse von TE Domänen bildet. Des Weiteren wurde die Rolle zweier P450 Enzyme, die an der Modifikation des Ajudazolgrundgerüstes beteiligt sind nachgewiesen.
C. crocatus und S. cellulosum produzieren strukturell unterschiedliche Varianten des antimycotischen Sekundärstoffes Thuggacin. Durch die Identifizierung, Charakterisierung und dem anschließendem Vergleich der beiden Biosynthesewege konnten die entsprechenden enzymatischen Mechanismen, die zu den strukturellen Unterschieden führen, aufgeklärt werden. So konnte gezeigt werden, dass im S.cellulosum Biosyntheseweg ein zu Crotonyl-CoA-Reduktasen/Carboxylasen homologes Enzym für den Einbau der Hexyl-Seitenkette verantwortlich ist. Die unterschiedlichen Hydroxylierungen beruhen vermutlich auf der variablen Aktivität einer FMN abhängigen Monooxygenase, deren Funktion in C.crocatus nachgewiesen wurde.
In weiteren Experimenten wurden die Entstehung der Pyrrolstartereinheit in der Leupyrrinbiosynthese in Sorangium cellulsoum So ce690 und die Bildung des Disorazol Dilactons in Sorangium cellulosum So ce12 biochemisch untersucht.
2010-06-09
2017-07-12T07:26:52Z
2010-06-09
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-31526
hdl:20.500.11880/22700
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22644
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227022019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Time-resolved diffraction experiments on piezoelectric actuators
Zeitaufgelöste Röntgendiffraktionsexperimente an piezoelektrischen Aktoren
Rödl, Florian
Arzt, Eduard
ddc:500
Röntgenweitwinkelstreuung
PZT
Zeitauflösung
zeitaufgelöste Röntgendiffraktion
dünne Schichten
Domänen
Piezokeramiken
time-resolved diffraction
One of the most important features of many common functional ceramics is piezoelectricity, a phenomenon which is not fully under-stood so far. Especially the time-dependent response and its role in the deterioration of properties due to fatigue has not been much investigated. The present work focuses especially on time-resolved X-ray-diffraction, but also uses static methods to improve the understanding of dynamic processes that occur during switching in piezoelectric actuators and how they change with increasing fatigue. Micro-tensile tests were performed on the electrode material; the flow stress strongly depends on the temperature. A new synchrotron-based method was developed to study actuators in-situ during switching on timescales of microseconds. The results show different relaxation processes depending on the sample position. In a pre-stressed actuator, only one 90° domain relaxation can be found in the active area. In an actuator without prestress, we can find two different 90° domain relaxation processes. In the inactive area of the actuator, only slow processes can be seen as no domain processes occur. Close to the electrode edge, high mechanical stresses yield defect relaxations which could be a reason for stronger fatigue in this area. In this work it was shown that synchrotron experiments can be used to study the domain processes in piezoelectric materials. Future experiments could use this method to study the influence of fatigue on domain processes.
In der vorliegenden Arbeit wurden in situ Untersuchungen an piezoelektrischen Aktoren durchgeführt. Dabei wurden keine Modellsysteme, sondern annähernd originale Bauteile aus Common-Rail Einspritzanlagen verwendet. Neben mikrostrukturellen Untersuchungen wurden Mikrozugversuche an AgPd-Elektroden und zeitaufgelöste Röntgenexperimente durchgeführt. Die Mikrozugversuche zeigten, dass die Fließspannung des Elektrodenmaterials stark von der Temperatur abhängt. Eine Methode für zeitaufgelöste Röntgendiffraktionsexperimente an Aktoren wurde entwickelt. Untersuchungen des Gesamtaktors zeigen kein starkes Relaxationsverhalten, im Gegensatz zu einzelnen Körnern. Während bei dem unter Vorspannung stehenden geteilten Aktor nur ein 90° Domänenprozess zu messen war, zeigte der freistehende Babyaktor zwei 90° Schritte. Ursache hierfür ist die Ausrichtung von Domänen durch die mechanische Vorspannung. Im inaktiven Bereich des Aktors wurde nur eine schwache Relaxation gemessen, da keine Domänenprozesse stattfinden. An der Elektrodenspitze kommt es durch hohe mechanische Spannungen zu ausgeprägten Defektrelaxationen, die das Ermüdungsverhalten beeinflussen könnten. Es wurde gezeigt dass mit Hilfe von Röntgenstrahlen das Domänenrelaxationsverhalten piezoelektrischer Aktoren gemessen werden kann und von der Position auf der Probe abhängt. In zukünftigen Untersuchungen kann mit der hier entwickelten Methode der Einfluss des Ermüdungszustandes auf die Domänenprozesse untersucht werden kann.
2010-06-29
2017-07-12T07:26:53Z
2010-06-29
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-31676
hdl:20.500.11880/22702
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22646
eng
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Alle Ressourcen in diesem Repository sind urheberrechtlich geschützt
oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227152019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
A powerful combination of computational methods on the road toward potent non-steroidal inhibitors of steroidogenic enzymes involved in hormone-dependent diseases
Leistungsstarke Kombination computer-gestützter Methoden zur Findung potenter nicht-steroidaler Hemmstoffe von steroidogenen Enzymen, welche eine wichtige Rolle in hormon-abhängigen Krankheiten spielen
Negri, Matthias
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Enzyminhibitor
Enzymkinetik
Cytochrome
CADEMO
CADD
Molekulardesign
Molekulardynamik
Steroidogenese
CYP17
CYP19
CYP11B2
17beta-HSD1
pharmacophore model
Different computational methods have been applied to the development of non-steroidal inhibitors of steroidogenic enzymes for the treatment of hormone-sensitive diseases, like breast and prostate cancer and hypertension. A high-quality homology model of CYP17 was created and used for docking studies. Three binding modes were identified and SAR for different CYP17-inhibitor classes, substantiated by ab initio calculations, could be derived and used in further drug design leading to improved potency. Docking studies and ligand cluster analysis for a series of CYP19 inhibitors resulted in a binding mode, well explaining their different inhibitory potencies. The derived SAR were used in ongoing drug design, resulting so far in highly potent CYP19 inhibitors. The kinetic cycle of 17β-HSD1 was hypothesized based on biochemical data, analysis of the crystal structures and a multi-trajectory MD approach and provided insights in protein motion. These were translated into the drug design process. An ensemble docking study was performed for bis(hydroxyphenyl)-arenes, potent 17β-HSD1 inhibitors, and two conformation-dependent binding modes were identified. MD simulations and quantum-chemical calculations identified one of them as the more plausible, suggesting this class of compounds to dysfunction the enzyme dynamics. Two pharmacophore models were derived from CYP11B2 inhibitors and combined into a ligand- and structure-based approach, which led to a new class of potent CYP11B2 inhibitors.
Verschiedene computergestützte Methoden wurden in der Entwicklung von nicht-steroidalen Hemmstoffen steroidogener Enzyme angewandt. Diese Inhibitoren sollen zur Behandlung hormon-abhängiger Krankheiten eingesetzt werden. Ein qualitativ-hochwertiges CYP17 Homologiemodell wurde erstellt und in Docking Studien verwendet. Drei Bindungsmodi konnten identifiziert werden und Struktur-Wirkungsbeziehungen wurden für verschiedene CYP17 Hemmstoffklassen abgeleitet und erfolgreich in eine weitere Hemmstoffentwicklung eingebaut. Dockingstudien und Clusteranalysen einer Reihe von CYP19 Inhibitoren ergaben einen plausiblen Bindungsmodus und die daraus gewonnenen Erkenntnisse führten in laufenden Projekten zu höchst potenten Hemmstoffen. Der kinetische Zyklus von 17β-HSD1 wurde postuliert basierend auf biochemischen Literaturdaten, Kristallstrukturenanalyse und einem multiplen MD-Ansatz, welcher wichtige Einblicke in die Dynamik des Enzyms lieferte. Diese wurden als ensemble docking Ansatz in die Entwicklung einer Klasse hochpotenter 17β-HSD1 Inhibitoren eingebaut und ergaben zwei Enzymkonformations-abhängige Bindungsmodi. MD-Simulationen und quantenchemische Methoden identifizierten einen davon als plausibler. Dabei scheinen Substanzen dieser Klasse die Enzymdynamik zu stören.
Zwei Pharmakophormodelle wurden basierend auf CYP11B2-Hemmstoffen erstellt und in einen Ligand- und Struktur-basierten Ansatz eingebaut. Dieser führte zu einer neuen Klasse von potenten und selektiven CYP11B2-Inhibitoren.
2010-08-20
2017-07-12T07:26:58Z
2010-08-20
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-32847
hdl:20.500.11880/22715
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22659
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227162019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Liver-specific overexpression of the IGF2 mRNA binding protein p62 induces a fatty liver disease phenotype
Leberspezifische Überexpression des IGF2 mRNA bindenden Proteins p62 induziert einen Fettleber-Phänotyp
Tybl, Elisabeth
Kiemer, Alexandra Kathrin
ddc:500
Leberzellkrebs
Insulin-like Growth Factor II
Autoantigen
Transgene Tiere
PTEN
pAKT
NFkB
mRNA binding protein
Although p62 was originally identified to be highly expressed in HCC tissue, its potential functional implications in liver disease have as yet been completely unknown. Therefore, aim of this work was to elucidate functional implications of hepatic overexpression of the tumor-associated autoantigen p62. This is why liver-specific p62 transgenic mice were generated, which express hup62 under control of the liver enriched activator protein (LAP). Due to the IGF2 mRNA-binding properties of p62, a potential regulation of IGF2, a metabolically active growth factor, was hypothesized. In fact, a highly increased expression of IGF2 and the closely associated H19 RNA, with which it shares an imprinting control region, could be demonstrated. Investigations on IGF2 and H19 mRNA stability in isolated hepatocytes employing the transcription inhibitor actinomycin D (ActD) revealed no alterations in mRNA turnover upon p62 expression. Since IGF2 and H19 are imprinted genes, allele-specific expression of both genes was investigated. However, no changes in allele-specific expression could be determined upon expression of p62. Histological examinations showed the phenotype of a fatty liver in p62 transgenic mice at a very early age when also IGF2 expression was highest. Regarding potential IGF2 downstream targets, PTEN was downregulated in p62 transgenic animals, whereas an increase in the phosphorylation of AKT was demonstrated. Since a respective signalling status might exert anti-apoptotic actions, apoptotic cell death was determined, measured as caspase-3-like activity. In fact, a decrease upon ActD/TNF-α induced apoptosis manifested in hepatocytes from p62 transgenic mice. In order to investigate the causal correlation between increased IGF2 and H19 and p62 overexpression also in a human system, siRNA-mediated knockdown of p62 was performed in human hepatoma cell lines confirming p62 as a regulator of both IGF2 and H19. In summary, these results for the first time characterize functional implications of p62 overexpression and suggest the induction of an anti-apoptotic, fatty liver phenotype.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte erstmals die Rolle des Autoantigens p62, das in HCC Tumoren nachgewiesen werden konnte, mit Hilfe eines Mausmodells untersucht werden. Hierzu wurden Mäuse generiert, die das humane p62 Protein unter Kontrolle des liver enriched activator proteins (LAP) leberspezifisch exprimieren. Aufgrund der postulierten insulin-like growth factor 2 (IGF2) mRNA-bindenden Eigenschaft von p62 wurde vermutet, dass p62 die Expression des metabolischen Wachstumsfaktors IGF2 regulieren könnte. In der Tat zeigten Untersuchungen einen starken Anstieg der IGF2 und H19 Expression in p62 transgenen Tieren. Dabei übt p62 weder einen Einfluss auf die mRNA Stabilität aus, noch verursacht es eine Änderung der Allel-spezifischen Expression von IGF2 und H19. Mit Auftreten der höchsten IGF2 Expression in p62 transgenen Tieren konnte gleichzeitig der Phänotyp einer Fettleber zu einem frühen Alterszeitpunkt gezeigt werden. Untersuchungen von Zielstrukturen, die IGF2-vermittelt reguliert werden, konnten eine Aktivierung von AKT sowie eine Inaktiverung von PTEN zeigen. Nachdem diese Ergebnisse einen anti-apoptotischen Phänotyp vermuten ließen, wurde die Apoptoserate anhand der Caspase-3-Aktivität bestimmt. In Hepatozyten aus p62 transgenen Tieren konnte in der Tat ein Schutz vor induzierter Apoptose nachgewiesen werden. Der Zusammenhang zwischen erhöhter p62, IGF2 und H19 Expression konnte abschließend mit Hilfe eines RNA-Interferenz Ansatzes im menschlichen System untermauert werden.
2010-08-20
2017-07-12T07:26:58Z
2010-08-20
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-32901
hdl:20.500.11880/22716
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22660
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227202019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
The potential of silica nanoparticles as oral drug carriers
Das Potential von Silika-Nanopartikeln als orale Arzneistoffträger
Neumeyer, Andrea
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Nanopartikel
Arzneistoffträger
Orale Applikation
Siliciumdioxid
Biokompatibilität
Quantifizierung
zelluläre Aufnahme
Caco-2 Zellen
Silika
nanoparticles
silica
biocompatibility
quantification
cellular uptake
Caco-2 cells
Silika-Nanopartikel zeigen vielversprechende Eigenschaften als orale Arzneistoffcarrier. Diese Anwendung impliziert einen engen Kontakt zwischen Partikeln und biologischen Systemen. Daher ist es unerlässlich die Assoziierung und Aufnahme von Partikeln zu untersuchen sowie ihr zytotoxisches und oxidatives Potential zu bewerten. Eine innovative Methode zur kombinierten Detektion von Zytotoxizität und oxidativem Stress zeigte, dass unmodifizierte Nanopartikel bis zu einer Größe von 84 nm einen größen-, zeit- und konzentrationsabhängigen zytotoxischen Effekt auf Caco-2 Zellen aufwiesen. Größere sowie Polyethylenglykol-modifizierte Partikel hatten dagegen keine zellschädigende Wirkung. Ein oxidatives Potential konnte von keinem der Partikel verzeichnet werden. Diese Toxizitätsstudien korrelierten mit zellulären Assoziierungs- und Aufnahmeexperimenten. Nanopartikel, die einen zytotoxischen Effekt zeigten, demonstrierten auch eine starke Assoziierung mit Caco-2-Zellen oder wurden sogar in diese aufgenommen. Die Markierung der Partikel mit Propidiumiodid (PI) ermöglichte dabei eine deutliche Unterscheidung zwischen adsorbierten und aufgenommenen Nanopartikeln. Die Identifizierung der zellulären Mechanismen, die in der partikulären Aufnahme involviert sind, wurde dadurch erleichtert. Silika-Nanopartikel fungierten zudem als Carrier für das membran-impermeable PI. Freies PI wurde nicht in Caco-2-Zellen aufgenommen, wohingegen partikelgebundenes PI zeitabhängig internalisiert wurde.
Silica nanoparticles show promising characteristics as oral drug delivery carriers. This application implies a close contact with biological systems, therefore it is essential to investigate the cellular binding, uptake and transport properties of nanoparticles. Furthermore, their oxidative and cytotoxic potential has to be evaluated. A novel non-invasive assay for the combined determination of cytotoxicity and oxidative stress exhibited that unmodified nanoparticles with a size up to 84 nm caused a size-, time- and concentration-dependent cytotoxic effect in Caco-2 cells. In contrast, larger and poly ethylene glycol-modified nanoparticles provoked no deleterious effects. However, none of these particles showed an oxidative potential. Cytotoxicity studies correlated with cell association, uptake and transport experiments: Nanoparticles, which demonstrated a cytotoxic effect, were also in a strong association with Caco-2 cells or were even internalized. Thereby, the novel labelling of nanoparticles with propidium iodide (PI) allowed a clear distinction between adsorbed and internalized nanoparticles in a quantitative way which facilitated the identification of cellular mechanisms involved in the uptake of nanoparticles. Furthermore, silica nanoparticles could function as drug carriers for the membrane-impermeable compound PI. Free PI molecules were not able to enter Caco-2 cells, whereas nanoparticle bound PI was internalized time-dependently.
2010-09-30
2017-07-12T07:26:59Z
2010-09-30
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-33788
hdl:20.500.11880/22720
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22664
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227222019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Regulation of Toll-like receptor expression by glucocorticoid-induced leucine zipper and p38 MAPK in human endothelial cells
Regulation der Toll-like Rezeptor Expression durch Glucocorticoid-induzierten Leucin Zipper und p38 MAPK in humanen Endothelzellen
Hirschfelder, Kerstin
Kiemer, Alexandra K.
ddc:500
Arteriosklerose
Entzündung
Signaltransduktion
Toll-like-Rezeptoren
Tumor-Nekrose-Faktor
Endothel
p38 MAPK
Endothelzellen
Signaltransduktion
Vaskulatur
Transkriptionsfaktor
atherosclerosis
endothelial cells
signal transduction
vasculature
inflammation
arteries
Inflammatory actions in the pathophysiology of atherosclerosis are characterized by an activation of the endothelium as well as an increased expression of Toll-like receptor (TLR) 2. Aim of this work was to decipher the roles of glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ) and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) in endothelial TLR expression. A pronounced constitutive expression of the anti-inflammatory mediator GILZ was found in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), which was downregulated under inflammatory conditions. This GILZ downregulation paralleled by TLR2 upregulation was confirmed in human atherosclerotic vessels. Mechanistic examinations showed that GILZ decay led to a nuclear translocation and activation of the transcription factor NF-kB resulting in upregulation of TLR2 expression. Pharmacological inhibition of p38 MAPK as well as overexpression of dominant negative p38alpha MAPK showed a positive involvement of p38 MAPK in inflammatory TLR2 expression. This p38 MAPK-mediated action, however, was independent of GILZ. Taken together, this work provides evidence for a role of GILZ and p38 MAPK in the regulation of inflammatory TLR expression in human endothelial cells and provides insides for a better understanding of inflammatory actions in atherosclerosis.
Die Pathophysiologie der chronisch entzündlichen Erkrankung Arteriosklerose ist durch eine Aktivierung des Endothels sowie durch eine erhöhte Expression des Toll-like Rezeptors (TLR) 2 charakterisiert. Ziel dieser Arbeit war, eine mögliche Beteiligung des Glucocorticoid-induzierten Leucin Zippers (GILZ) sowie der p38 Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) bezüglich der Regulation der endothelialen TLR Expression zu untersuchen. In Endothelzellen, isoliert aus humanen Nabelschnurvenen (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC), wurde eine konstitutive Expression des anti-inflammatorischen Mediators GILZ nachgewiesen, die durch inflammatorischen Stimulus erniedrigt wurde. Diese verringerte GILZ Expression bei gleichzeitiger Induktion von TLR2 konnte in humanen arteriosklerotischen Gefäßen bestätigt werden. Mechanistische Untersuchungen zeigten, dass die Abwesenheit von GILZ zu einer nukleären Translokation sowie zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB führt, die wiederum eine Erhöhung der TLR2 Expression zur Folge hat. Für p38 MAPK wurde durch pharmakologische Inhibierung sowie Überexpression dominant negativer p38alpha MAPK ebenfalls eine Beteiligung an der Expression von TLR2 gezeigt, die zudem unabhängig von GILZ war. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass sowohl GILZ als auch p38 MAPK eine Rolle in der Expression von TLR2 humanen Endothelzellen spielen und trägt daher zu einem besseren Verständnis der entzündlichen Prozesse in der Arteriosklerose bei.
2010-10-01
2017-07-12T07:26:59Z
2010-10-01
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-33750
hdl:20.500.11880/22722
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22666
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227372019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Pharmaceutical aerosol deposition device on cell cultures (PADDOCC) : development of an in vitro test system based on pulmonary epithelial cells
Pharmaceutical aerosol deposition device on cell cultures (PADDOCC) : Entwicklung eines auf pulmonalen Epithelzellen basierendes in vitro Testsystem
Hein, Stephanie
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Lunge
Arzneimittel
In-vitro-Kultur
Sedimentation
Calu-3 Zellen
Pulveraeroso l
Deposition
sedimentation
calu-3 cells
dry powder aerosol
deposition
Drug application via the lung is a convenient route of administration, because of its easy handling and the special anatomy of the lung. A large surface area, rapid absorption through the thin alveolar epithelium, low enzymatic activity and a direct access to the blood circulation are the advantages of the administration of local as well as systemic drugs to the lung. However, new drugs and formulations have to be tested for their safety and efficacy, especially since new particle types like nanoparticles or liposomes arein the focus of the development of new drugs. Such testing is often done by animal experiments due to a lack of appropriate in vitro models. Therefore a new in vitro model was developed allowing to test aerosolisation, deposition as well as subsequent absorption of aerosol formulations. The so-called "Pharmaceutical Aerosol Deposition Device On Cell Cultures" (PADDOCC) system relies on sedimentation, which is the main deposition mechanism in the deep lung. The PADDOCC system, comprising of air flow control unit, aerosolisation unit and deposition unit, is able to generate the dry powder aerosol and deposit only the respirable fraction simultaneously onto three air-liquid interface grown cell monolayers. After the deposition several endpoints such as cytotoxicity or absorption are determined. Budesonide and salbutamol sulphate, two important drugs, which are used to treat asthma were tested, and dierent absorption prfiles compared to standardised transport studies could be detected.
Die Lunge ist ein erfolgversprechender Ort für eine Arzneistoffgabe, da ihre Anatomie viele Vorteile bietet. Sie besitzt eine große Oberfläche, eine schnelle Absorption des Arzneistoffes durch das dünne Alveolarepithelium, eine geringe enzymatische Aktivität sowie einen direkten Zugang zum Blutkreislauf. Neu entwickelte Arzneistoffformulierungen zur inhalativen Anwendung müssen in Bezug auf ihre Sicherheit und Wirksamkeit getestet werden, in besonderem Maße seitdem neue Partikeltypen wie Nanopartikel oder Liposomen in den Focus der Neuentwicklungen gerückt sind. Diese Tests werden meistens mit Tiermodellen durchgeführt, da es keine oder kaum geeignete in vitro Modelle gibt. Deshalb wurde ein neues in vitro Modell entwickelt, mit dem die Aerosolisierung, die Deposition sowie die nachfolgende Absorption einer Arzneistoffformulierung untersucht werden kann. Das "Pharmaceutical Aerosol Deposition Device On Cell Cultures" (PADDOCC) System basiert auf der Sedimentation der Aerosolteilchen eines Arzneistoffes auf einem Zellmonolayer, da die Sedimentation der Hauptdepositionsmechanismus in der tiefen Lunge ist. Das PADDOCC System, bestehend aus einer Kontrolleinheit, einer Verneblungseinheit sowie einer Depositionseinheit, generiert ein Trockenaerosol und deponiert nur die lungengängige Fraktion gleichzeitig auf drei, an der Luft-Grenzschicht gewachsenen, Zellmonolayer. Danach können verschiedene Endpunkte wie Zytotoxizität oder Absorption bestimmt werden. Budesonid und Salbutamolsulfat, die zwei bedeutende Therapeutika in der Asthmatherapie darstellen, wurden getestet und es wurden veränderte Absorptionsprofile im Vergleich zu standardisierten Transportexperimenten mit diesen Arzneistoffen gefunden.
2010-12-22
2017-07-12T07:27:06Z
2010-12-22
2010
2011-12-12
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-34834
hdl:20.500.11880/22737
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22681
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227392019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Combined assessment of drug dissolution and epithelial permeability : implementation of online TEER measurement and extension to BCS class III and IV compounds
Kombinierte Bestimmung von Arzneistofffreisetzung und epithelialer Permeabilität : Implementierung der online TEER Messung und Erweiterung für BCS Klasse III und IV Substanzen
Mündörfer, Marco
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Permeation
Resorption
Pharmazeutische Technologie
Zellkultur
dissolution
permeation
in vitro absorption
Caco-2
Measurement of drug dissolution and permeation of solid oral dosage forms in a combined experiment is a quite obvious research approach that nevertheless has only been sparsely considered up to now. In the present work an existing apparatus that has been developed for the mentioned purpose has been adapted to comply with the requirements for the analysis of low permeable compounds of BCS classes III and IV. Next to that, the apparatus was developed further in a way that the course of transepithelial electrical resistance (TEER) could be recorded throughout conduction of an experiment. Implementation of this tool was supposed to provide for the opportunity to survey and demonstrate the integrity of a Caco-2 cell monolayer throughout an experiment. Furthermore, it was of interest to evaluate in how far the novel method was suitable for the analysis of the influences of excipients, as e.g. EDTA, on the permeability of the paracellular pathway. Finally, it was pointed out that the revised apparatus is able to analyze Lasix® 40mg furosemide tablets correctly. Hence, the research approach has advanced significantly to the aim of the establishment of an in vitro method for the targeted formulation development of low permeable compounds.
Die Messung der Freisetzung und der Permeation von Arzneistoffen aus festen Darreichungsformen zur peroralen Anwendung in einem kombinierten Experiment ist ein naheliegender, bislang jedoch wenig behandelter Forschungsansatz. In der vorliegenden Arbeit wurde eine in einer vorangegangenen Arbeit zu diesem Zweck entwickelte Apparatur an die Erfordernisse zur Analyse von langsam permeierenden Substanzen der BCS Klassen III und IV angepasst. Weiterhin wurde die Apparatur dahingehend weiterentwickelt, dass der Verlauf des transepithelialen elektrischen Widerstandes während eines Versuches aufgezeichnet werden kann. Das Ziel dieser Maßnahme war es, die Prüfung der Integrität der Caco-2 Zellen, die in diesem Modell als Permeationsbarriere dienen, während eines Versuches zu ermöglichen. Daneben war es von Interesse zu untersuchen, inwieweit sich die neue Methode für die Analyse des Einflusses von Hilfsstoffen, wie beispielsweise EDTA, auf die Durchlässigkeit des parazellulären Transportweges eignet. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die optimierte Apparatur bei der Analyse von Lasix® 40 mg Furosemid Tabletten, als Beispiel für eine BCS Klasse IV Substanz, korrekte Ergebnisse liefert. Somit ist der Forschungsansatz dem Ziel der Entwicklung einer in vitro Methode zur gezielten Formulierungsentwicklung von Problemarzneistoffen ein wesentliches Stück näher gekommen.
2010-12-27
2017-07-12T07:27:06Z
2010-12-27
2010
2011-03-22
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-35031
hdl:20.500.11880/22739
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22683
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227402019-07-17T06:35:00Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Self-organized cyclic patterns in muscles and microscopic swimming
Selbstorganisierte zyklische Muster in Muskeln und beim Schwimmen von Mikroobjekten
Günther, Stefan
Kruse, Karsten
ddc:500
Reynolds-Zahl
Muskel
Zelle
Zellskelett
Muskelwellen
Wellenmuster in aktiven Materialien
kleine Reynoldszahlen
muscles
muscle waves
wave patterns in active media
low reynold number
Living cells are self-sustained units of organisms. Within cells the complex interplay of a high amount of proteins and other molecules relies on information that is encoded in the dna. The self-organisation of cellular constituents might play an important role in cellular activity. There is evidence for self-organization in the cytoskeleton of cells where small numbers of interacting proteins create patterns of a higher order. The cytoskeleton of muscles has been shown to exhibit cyclic behaviour and wave patterns in absence of regulatory mechanisms. This thesis provides evidence that the experimental results can be accounted for by the self-organization of cytoskeletal filaments and motor proteins. A microscopic model exposes that the dynamics is excitable. Continuous descriptions of muscles reveal a non-hydrodynamic mode that accounts for wave generation. The phenomenological coefficients can directly be related to microscopic parameters. For this study, the principles that underly spontaneous muscle oscillations are used in a conceptual design of a simple self-driven swimmer at low Reynolds number. The swimmer's motion can self-organize into directed movement by dynamically breaking the swimmer's symmetries.
Lebende Zellen sind selbständige Untereinheiten von Organismen. Innerhalb von Zellen beruht das komplexe Wechselspiel einer großen Menge verschiedener Proteinarten und anderer Moleküle auf Informationen die in der DNA kodiert sind. Dabei könnte die Selbstorganisation der Bestandteile von Zellen eine wichtige Rolle in der zellulären Aktivität spielen. Es gibt Hinweise auf selbstorganisierte Prozesse im Zytoskelett von Zellen wobei wenige verschiedenartige Proteine miteinander wechselwirken und Ordnungsstrukturen erzeugen. Im Zytoskelett von Muskeln werden oszillatorische Aktivitäten und Wellenmuster beobachtet, ohne regulatorische Mechanismen. Diese Arbeit findet Hinweise, dass die Selbstorganisation von Filamenten und Motorproteinen des Zytoskeletts die experimentellen Ergebnisse erklären kann. Ein mikroskopisches Model zeigt zudem die Anregbarkeit der Dynamik. In Beschreibungen von Muskeln als kontinuierliches Medium kann eine nicht hydrodynamische Mode identifiziert werden, die für die Wellenphänomene von essentieller Bedeutung ist. Dabei können phänomenologische Koeffizienten mikroskopischen Parametern zugeordnet werden. Die Prinzipien, die zu spontanen Muskeloszillationen führen, werden in einer Konzeptstudie eines einfachen Schwimmers bei kleinen Reynolds-Zahlen genutzt. Die Bewegung des Schwimmers kann sich von selbst in einen Zustand gerichteter Bewegung organisieren indem sie die Symmetrien des Schwimmers dynamisch bricht.
2010-12-28
2017-07-12T07:27:07Z
2010-12-28
2009
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-26303
hdl:20.500.11880/22740
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22684
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227422019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Transport of metal oxide nanoparticles across the human air-blood barrier : interactions with physiologically relevant media and proteins
Transport von Metalloxid-Nanopartikeln über die Luft-Blut-Schranke : Interaktionen mit physiologisch relevanten Medien und Proteinen
Schulze, Christine
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Lunge
Nanopartikel
Surfactant-Protein A
In vitro
Luft-Blut-Schranke
Nanotoxikologie
air-blood-barrier
nanotoxicology
There is still a big gap between nanoparticle production and industrial use on one hand and the knowledge of their toxicological potential on the other. In vitro assays are a common tool to investigate toxicity of substances, but for nanoparticles, some especially dispersion related pitfalls must be recognized and bypassed prior to correct interpretation of results. One special feature of nanoparticles is the possible interaction with proteins in cell culture media and with physiological proteins as well. On one hand, those interactions can have an influence on the agglomeration state, on the other hand cell reactions and hence the toxicological potential can be altered.
Investigations with the model protein BSA or FCS, respectively, revealed differences for the adsorption onto nanoparticles, although the particles tested had very similar physico-chemical properties. BSA seemed to adsorb to the particles in different conformations, and the state of agglomeration must be taken into account to draw conclusions about protein adsorption.
Protein adsorption was also confirmed for physiologically relevant Surfactant protein A to eight different nanoparticles of partially the same bulk material. Also here, differences in protein adsorption could be detected. In contrast to BSA, Sp-A does not have much impact on the agglomeration state of the particles.
Inhaled particles might cross the air-blood barrier and enter the blood stream. Hence, an in vitro air-blood barrier model was adapted to transport experiments with nanoparticles. The cell culture conditions were adapted and the transport characteristics of the cells confirmed. Except two different CeO2 particles, no metal oxide nanoparticle transport could be detected.
Noch immer ist die Schere zwischen der Produktion und großtechnischer Nutzung von Nanopartikeln einerseits und deren toxikologischen Potentials andererseits recht groß. In vitro-Versuche sind ein oft genutztes Mittel zur Bestimmung der Toxizität von Substanzen, für Nanopartikel jedoch müssen in diesem Zusammenhang bestimmte Fallen erkannt und umgangen werden, um so generierte Ergebnisse richtig zu interpretieren. Eine Besonderheit von Nanopartikeln ist deren Interaktion mit Proteinen in Zellkulturmedien, aber auch mit physiologisch relevanten Proteinen. Einerseits können solche Interaktionen einen Einfluss auf den Agglomerationsgrad der Partikel, andererseits auf die Reaktion der Zelle auf einen solchen, mit Proteinen überzogenen Partikel haben. Somit kann sich das toxikologische Potential von Nanopartikeln in beide Richtungen verschieben.
Bei Untersuchungen mit dem Modellprotein BSA bzw. FCS konnten Unterschiede in der Adsorption an drei Nanopartikel gleichen Materials als auch sehr ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften aufgezeigt werden. Dabei zeigte sich, dass BSA wahrscheinlich in unterschiedlichen Konformationen an die Partikel bindet. Außerdem muss, um Proteinadsorption richtig einschätzen zu können, der Agglomerationsgrad der Partikel mit einbezogen werden.
Protein-Adsorption konnte nicht nur für Modellproteine, sondern auch für das physiologisch relevante Surfactant Protein A an acht verschiedene Partikel, teilweise aus gleichem Material, nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu BSA hat die Dispersion in Sp-A-haltigem Medium keinen positiven Einfluss auf das Deagglomerationsverhalten der Partikel.
Inhalierte Partikel können möglicherweise die Blut-Luft-Schranke passieren und so in den Blutkreislauf gelangen. Um den Partikelübertritt zu untersuchen, wurde ein in vitro Zellkultur-Modell an die Besonderheiten von Transportversuchen mit Nanopartikeln angepasst. Die Zellkultur-Bedingungen wurden angepasst und anschließend die Transporteigenschaften der Zellen mit diesen veränderten Gegebenheiten bestätigt. Mit Ausnahme der beiden getesteten CeO2-Partikel konnte im Rahmen der Versuchsdurchführung bei keinem Nanopartikel ein Transport festgestellt werden.
2011-02-07
2017-07-12T07:27:08Z
2011-02-07
2010
2011-02-09
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-35352
hdl:20.500.11880/22742
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22686
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227432019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Sequence based methods for the prediction and analysis of the structural topology of transmembrane beta barrel proteins
Auf Sequenzen beruhende Methoden für die Vorhersage und Analyse struktureller Topologien transmembraner beta-Barrel Proteine
Hayat, Sikander
Helms, Volkhard
ddc:500
Proteine
Membranproteine
Topologische Struktur
Strukturanalyse
Barrel <alpha
beta->
Transmembran-Domäne
transmembrane beta barrel
protein structure prediction
exposure status
Transmembrane proteins play a major role in the normal functioning of the cell. Many transmembrane proteins act as a drug target and hence are of utmost importance to the pharmaceutical industry. In spite of the significance of transmembrane proteins, relatively few transmembrane 3D structures are available due to experimental bottlenecks. Due to this, it is imperative to develop novel computational methods to elucidate the structure and function of these proteins. The two major classes of transmembrane proteins are helical membrane proteins and transmembrane beta barrel proteins. Relatively more 3D structures of helical membrane proteins have been experimentally determined and in general, the majority of computational methods in the realm of transmembrane proteins deal with helical membrane proteins. However, in the recent years there has been an increased interest in the development of computational methods for the transmembrane beta barrel proteins. In this study, I focus on the transmembrane beta barrel proteins. More specifically, I present here computational methods for the prediction of the exposure status of the residues in the membrane spanning region of the transmembrane beta barrel proteins. To the best of our knowledge, the exposure status prediction is a novel problem in the realm of transmembrane beta barrel proteins. The knowledge about the exposure status of the membrane spanning residues is then used to analyse the structural properties of transmembrane beta strands. The exposure status information is also employed to identify relevant physico-chemical properties that are statistically significantly different in the transmembrane beta strands at the oligomeric interfaces and the rest of the protein surface. A method for the prediction of the beta strands in the membrane spanning regions of putative transmembrane beta barrel proteins from protein sequence has also been developed. The computational method for strand prediction is novel in the respect that it also gives the exposure status information of the residues predicted to be in the predicted transmembrane beta strands. The two computational methods developed in this study have been made available as web services. In the future, the information about the exposure status of the residues in the transmembrane beta strands can be used to identify putative transmembrane beta barrels from proteomic data. The exposure status prediction can also be extended to predict the pore region of transmembrane beta barrel proteins from sequence, which could in turn be used in the function prediction of putative transmembrane beta barrels.
Die Klasse der Transmembranproteine übernimmt eine Reihe wesentlicher Funktionen innerhalb der Zelle. Daher eignen sich viele dieser Proteine als Ziele für medizinische Wirkstoffe und sind daher von außerordentlichem Interesse für die Pharmaindustrie. Trotz ihrer Wichtigkeit wurden bislang nur wenige drei-dimensionale Strukturen von Membranproteinen erfasst, denn deren experimentelle Bestimmung hat sich als ausgesprochen schwierig herausgestellt. Aus diesem Grund erweist sich die Entwicklung von in silico Methoden zur de novo Vorhersage von Struktur und Funktion dieser Proteine von als notwendige Strategie. Die beiden wesentlichen Klassen von Transmembranproteinen unterteilt man, basierend auf ihren charakteristischen Sekundärstrukturen, in alpha-helikale Proteine und beta-Barrels. Erstere machen den größeren Anteil an experimentell bestimmten Strukturen aus, und auch die meisten bislang vorgestellten in silico Methoden konzentrieren sich auf die Modellierung solch alpha-helikaler Strukturen. In den vergangenen Jahren stieg daher das Interesse an Methoden zur Modellierung von transmembranen beta-Barrels. Die vorliegende Disseration beschäftigt sich vorrangig mit dieser Klasse von Transmembranproteinen, insbesondere präsentieren wir ein Verfahren zur Vorhersage der Exposition ("Exposure';) zur Lipidschicht einzelner Residuen innerhalb der Transmembranregion von beta-Barrels. Diese Vorhersage der Exposition stellt bislang ein neuartiges Problem im Feld der beta-Barrels dar. Die daraus gewonnenen Informationen wurden zur Analyse der strukturellen Eigenschaften von Transmembranketten verwendet. Darüber hinaus können die Exposure-Daten zur Identifikation bedeutender physikochemischer Eigenschaften verwendet werden. Unsere Untersuchungen ergaben, dass zwischen transmembranen beta-strands an Oligomer-Interfaces und dem Rest der Proteinoberfläche statistisch signifikante Unterschiede bezüglich dieser Eigenschaften auftreten. Darüber hinaus stellen wir ein Verfahren zur sequenzbasierten Vorhersage von Transmembran-Residuen mutmaßlicher beta-Barrels vor, welches in Kombination mit der Vorhersage des Exposure-Status in dieser Form neuartig ist. Die beiden in dieser Studie vorgestellten Methoden sind online als Webdienste verfügbar. Basierend auf den Exposure-Vorhersagen von beta-Faltblättern ist es möglich, in künftigen Studien mutmaßliche transmembrane beta-Barrels aus Proteomdatenzu identifizieren.
2011-01-06
2017-07-12T07:27:08Z
2011-01-06
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-35134
hdl:20.500.11880/22743
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22687
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227472019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Asymmetric particles for pulmonary drug delivery
Asymmetrische Partikel zur pulmonalen Wirkstoffapplikation
Kohler, Dorothee Anna Luise
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Mikrofaser
Makrophage
Lunge
Templat Methode
pulmonal
Makrophagen
Aerosolisierung
microfiber
template technique
macrophage uptake
aerosolization
Targeted drug delivery and controlled release are current challenges in pulmonary drug delivery. The deposition pattern and clearance from deposition site are two key parameters for drug delivery carrier design. Asymmetric particles allow an increase in peripheral drug delivery compared to spherical particles and furthermore, affect particle clearance mechanisms from the lung. Therefore, the main aim of this thesis was to develop new synthesis strategies to produce well-dispersible, biocompatible, biodegradable microfibers with a variety of aspect ratios and porosities. The macrophage response to the resulting microfibers was investigated. The aerosolization properties of the resulting microfibers were examined. From the obtained results it can be concluded that:
1. A new template-assisted synthesis strategy to produce monodisperse microfibers with defined dimensions has been developed.
2. The technique has been extended to various materials and process parameters for cell testing, drug loading and aerosolization tests.
3. Microfibers were successfully taken up by macrophages, only when they were approached from the pointy end.
4. Aerosolization studies showed good dispersion properties of microfibers with relatively high fine particle fractions.
In summary, this new technique may allow to produce microfibers for pulmonary drug delivery, which will lead to a better understanding of their in vivo behaviour such as mucoadhesion, macrophage interaction and deposition behaviour.
Die aktuellen Herausforderungen der inhalativen Therapie sind die gezielte Wirkstoffdeposition und die kontrollierte Wirkstofffreisetzung in der Lunge. Asymmetrische Partikel haben dabei durch ihre erhöhte tiefe Lungendeposition und ihren Einfluss auf die Clearance-Mechanismen erhöhtes Interesse gefunden. Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung einer neuen Herstellungsmethode, um gut vereinzelte, biokompatible, bioabbaubare Mikrofasern mit variablen Aspektverhältnissen und Porositäten zu generieren. Weiteres Ziel war die Testung der Makrophagen-Mikrofaser-Interaktion und des Aerosolisierungsverhaltens. Die gewonnenen Ergebnisse führen zu folgenden Aussagen:
1. Es wurde eine neue Methode zur Herstellung monodisperser Mikrofasern mit definierten Maßen entwickelt.
2. Mikrofasern aus diversen Materialien wurden in späteren Versuchen für Zelltests, Wirkstoffbeladung und Aerosolisierungsstudien verwendet.
3. Die Aufnahme von Mikrofasern durch Makrophagen zeigte eine Korrelation zum Faserdurchmesser, wobei diese nur vom spitzen Ende her aufgenommen wurden.
4. Aerosolisierungsstudien zeigten eine gute Dispergierung der Mikrofasern mit hohen Fine-Particle-Fractions.
Die entwickelte Methode kann zu einer Optimierung der pulmonalen Wirkstoffapplikation und einem besseren Verständnis des Verhaltens asymmetrischer Partikel im Körper beitragen. Die Mukoadhesion, die Makrophagen-Interaktion und das Depositionsverhalten in der Lunge können mittels dieser Fasern weiter untersucht werden.
2011-01-28
2017-07-12T07:27:09Z
2011-01-28
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-35320
hdl:20.500.11880/22747
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22691
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227482019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Synthesis and biological activity of multifunctional sensor/effector catalysts
Synthese und biologische Aktivität von Multifunktionssensor/Effektor Katalysatoren
Shaaban, Saad
Jacob, Claus
ddc:500
Oxidativer Stress
Eintopfreaktion
Tumor
Multikomponente Reaktion
oxidative stress
multicomponent component reaction
chemogenomic assay
Increased generation of reactive oxygen species (ROS) and an altered redox status have long been observed in several types of cancer. This biochemical property of cancer cells might be exploited for therapeutic benefits since it might be possible to preferentially eliminate these cells by pharmacological ROS insults. Compounds able to modulate the intracellular redox state of cells have been developed, which effectively, yet also selectively, appear to kill cancer cells. Among the various agents employed to modulate the intracellular redox state of cells, certain redox catalysts containing quinone and chalcogen moieties have shown considerable promise since they are non-toxic on their own yet develop an effective, often selective cytotoxicity. A simple synthetic method based on the Passerini and Ugi multicomponent reactions has been developed for the synthesis of multifunctional redox catalysts. This method allowed the synthesis of a representative set of agents combining two, three or even four redox centres in one molecule in a good yield.
When incubated with cancer cells these multifunctional agents inhibited cell proliferation and induced both cell cycle delay and apoptotic cell death in low, often sub-micromolar concentrations. The cause was obviously OS, which was reflected by an enhanced ROS level together with a significant decrease in reduced glutathione. Interestingly, some of these redox active compounds showed quite low toxicity with normal human fibroblasts and endothelial cells, supporting the notion that such compounds might have a selective anticancer activity. Chemogenomic assays using a mutant library of Saccharomyces cerevisiae were used to look for chemical-genetic interactions. Analyzing the resulting chemical-genetic interaction profiles afforded a set of sensitive mutants. The corresponding knocked out genes of these mutants play a major role in the antioxidant defence system and are pivotal for the removal of toxic oxidants. Therefore, deletion of the respective genes might cause an OS sensitive phenotype of the mutant. These observations were in excellent agreement with the other cell-based assay performed as a part of this study. Finally, some of these compounds showed a potent antimicrobial activity evaluated against different fungal and bacterial strains.
Seit langem wird in mehreren Krebsarten eine erhöhte Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und ein veränderter Redox-Status beobachtet. Diese biochemische Eigenschaft von Krebszellen könnte für therapeutische Zwecke genutzt werden, indem diese Zellen durch eine weitere Erhöhung des ROS-Levels eliminiert werden können. Wirkstoffe, die den intrazellulären Redox-Status der Zellen modulieren, wurden hier entwickelt. Diese können effektiv aber auch selektiv Krebszellen abtöten. Von den verschiedenen untersuchten Substanzen sind vor allem Redoxkatalysatoren, die Quinone- und Chalcogenreste enthalten, Erfolg versprechend. Sie sind an sich nicht toxisch, zeigen aber eine effektive und selektive Zytotoxizität. Für die Synthese von solchen multifunktionalen Redoxkatalysatoren wurde eine einfache synthetische Methode basierend auf den Passerini und Ugi Multikomponenten Reaktionen entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Synthese eines repräsentativen Satzes von Substanzen mit hoher Ausbeute. Diese Substanzen enthalten zwei, drei oder sogar vier Redox-Zentren in einem Molekül.
Diese multifunktionalen Substanzen inhibieren die Zellproliferation in Krebszelllinien. Im niedrigen micromolaren Konzentrationsbereich hemmen sie den Zellzyklus und induzieren Apoptose. Diese Wirkung wurde durch oxidativen Stress (OS) vermittelt, was durch einen erhöhten ROS-Level zusammen mit einer deutlichen Abnahme von reduziertem Glutathion belegt werden konnte. Interessanterweise zeigen diese redox-aktiven Substanzen nur geringe toxische Effekte in primären humanen Fibroblasten sowie Endothelzellen, was die Annahme unterstützt, dass diese Substanzen einen selektiven Effekt auf Tumorzellen haben. Um chemo-genetische Wechselwirkungen dieser Stoffe zu identifizieren, wurden Experimente mit einer Bibliothek von Saccharomyces cerevisiae Mutanten durchgeführt. Dabei wurden mehrere Mutanten entdeckt, die sensitiv auf diese Stoffe reagieren. Die in diesen Mutanten deletierten Gene sind besonders bei der antioxidativen Kontrolle der Zellen von Bedeutung und spielen eine Schlüsselrolle bei der Beseitigung von toxischen Oxidantien. Die Deletion solcher Gene kann zu einem Phänotyp führen, der besonders empfindlich auf oxidativen Stress reagiert. Diese Ergebnisse stützen und bestärken die aus den zellbasierten Experimenten gewonnen Daten. Schließlich zeigen einige dieser Substanzen eine starke antimikrobielle Aktivität gegen verschiedene Pilz- und Bakterienstämme.
2011-02-10
2017-07-12T07:27:09Z
2011-02-10
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-35372
hdl:20.500.11880/22748
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22692
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227512019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Von Estron-Mimetika zu bicyclisch substituierten Hydroxyphenylmethanonen : Entwicklung neuer nichtsteroidaler Hemmstoffe der 17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1 (17beta-HSD1)
From estrone-mimetics to bicyclic substituted hydroxyphenylmethanones : development of new nonsteroidal inhibitors of 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase typ 1 (17beta-hsd1)
Oster, Alexander
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Brustkrebs
Endometriose
Hydroxysteroid-Dehydrogenasen
Östrogene
Estronderivate
Estradiol
Inhibitor
Struktur-Aktivitäts-Beziehung
17beta-HSD1
bicyclisch substituierte Hydroxyphenylmethanone
T47D
estrogenabhängige Erkrankungen
nichtsteroidale Hemmstoffe
17beta-hsd1
hydroxyphenylmethanone
estrogen dependent diseases
endometriosis
nonsteroidal inhibitor
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Kombination eines struktur- und ligandbasierten Designkonzeptes, welches zur Entwicklung einer neuen Substanzklasse von hochaktiven und selektiven Hemmstoffen der 17beta-HSD1 führt, den bicyclisch substituierten Hydroxyphenylmethanonen. Als Estron-Mimetika entwickelt, bildeten die 20 synthetisierten Verbindungen der heterocyclisch substituierten Biphenylole sowie die Ergebnisse molekularer Docking Studien derer potentesten Vertreter die Grundlage für das Design der neuen Hemmstoffklasse. Das Einschließen einer zusätzlichen, überwiegend lipophilen Bindetasche unterhalb des katalytischen Zentrums in ein neues 3-Punkt-Pharmakophor-Modell stellte den Startpunkt zur Synthese und Weiterentwicklung von mehr als 55 Derivaten der bicyclisch substituierten Hydroxyphenylmethanone dar. Neben einer sehr starken Hemmung der 17beta-HSD1 im z.T. einstelligen nanomolaren Bereich zeigen die potentesten Vertreter, dem therapeutischen Konzept entsprechend, eine hohe Selektivität gegenüber dem biologischen Gegenspieler 17beta-HSD2 (bis zu 50fach) sowie keine relevante Affinität gegenüber den beiden Estrogenrezeptoren ERalpha und ERbeta. Im Gegensatz zu den bereits bekannten Substanzklassen können diese Inhibitoren ihre starke Hemmung, detektiert im zellfreien Assay, zusätzlich in einem zellbasierten Assay mit der Brustkrebszelllinie T47D mit IC50-Werten im unteren nanomolaren Bereich, bestätigen. Einige Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer metabolischen Stabiltät mit humanen Lebermikrosomen evaluiert und ergänzen mit hohen bis mittleren intrinsischen Clearance-Werten, welche alle zwischen denen der marktbekannten Wirkstoffe Dextromethorphan und Verapamil lagen, ihre bislang sehr guten präklinischen Werte. Die pharmakokinetische Evaluierung von Verbindung II.14 sowie deren Einsatz in einem krankheitsorientierten Mausmodell, welches die in vivo-Wirksamkeit beweisen soll, wird aktuell durchgeführt. Bei einem positiven Verlauf werden weitere präklinische Tests unternommen.
The present work describes the combination of a structure- and ligandbased design concept, which led to the development of a new class of highly active and selective 17beta-HSD1 inhibitors, namely bicyclic substituted hydroxyphenylmethanones. Designed as estrone-mimetics, 20 synthesized compounds as well as molecular docking results of their most potent representatives provide the basis for the design of the new inhibitor class. The inclusion of an additional rather lipophilic subpocket, located beneath the catalytic center, in a new 3-point-pharmacophore model was the starting point for the synthesis and development of more than 55 inhibitors in the class of bicyclic substituted hydroxyphenylmethanones. Besides a strong 17beta-HSD1 inhibition in the very low nanomolar range, the most potent compounds show high selectivity toward the biological counterpart 17beta-HSD2 (up to 50 fold). Furthermore, they reveal neglectable affinity towards the estrogen receptors ERalpha and ERbeta according the therapeutic concept. In contrast to the already known compound classes, these inhibitors confirmed their strong inhibition, detected in the cell-free assay, in the breast cancer cell line T47D with IC50-values in the low nanomolar range. Metabolic stability of the most promising compounds was evaluated using human liver microsomes. Summarizing, these compounds reveal so far very good preclinical results with high to middle intrinsic clearances between the values of the marketed drugs dextromethorphan and verapamil. The pharmacokinetic evaluation of compound II.14 as well as its application in a disease-oriented mouse-model, which should prove its in vivo efficacy, is currently in progress. In case of positive results, further preclinical tests will be accomplished.
2011-02-22
2017-07-12T07:27:11Z
2011-02-22
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-35468
hdl:20.500.11880/22751
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22695
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227532019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Differential expression of pro- and anti-inflammatory mediators in pulmonary macrophages upon Toll-like receptor activation
Untersuchungen zur Expression pro- und anti-inflammatorischer Mediatoren nach Toll-like Rezeptor-Aktivierung in humanen Lungenmakrophagen
Hoppstädter, Jessica
Kiemer, Alexandra K.
ddc:500
Entzündung
Immunreaktion
Makrophage
Toll-like Rezeptoren
Cytokine
Signaltransduktion
Lungenmakrophagen
Alveolarmakrophagen
Tuberkulose
GlLZ
inflammation
pulmonary macrophages
Toll-like receptors
glucocorticoid-induced leucine zipper
Toll-like receptor (TLR) activation plays a crucial role in both infectious as well as non-infectious lung disease. TLRs are capable of sensing different microbial and viral molecular patterns, and TLR engagement is a prerequisite for the initiation of macrophage responses to infections. Thus, aim of this work was to elucidate different aspects of TLR activation in human pulmonary macrophages. Interestingly, the activation profiles of the two macrophage populations examined, i.e. alveolar and interstitial macrophages, differed largely, indicating that alveolar macrophages are more effective as a non-specific first line of defence against inhaled pathogens, whereas interstitial show a more pronounced regulatory function. The glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ) is highly expressed in human alveolar macrophages and critically attenuates inflammatory signalling pathways. The mechanisms of GILZ regulation in inflammation, however, have as yet been completely unknown. Our investigations on the expression of GILZ in human alveolar macrophages upon TLR activation reveal that GILZ is downregulated by different post-transcriptional mechanisms. Both the TLR signalling pathways and GILZ have emerged as potential therapeutic targets for the treatment of inflammatory lung diseases. Our results support this concept and contribute to a better understanding of their role in pulmonary immune homeostasis.
Die Aktivierung von Toll-like Rezeptoren (TLRs) ist von großer Bedeutung für den Verlauf infektiöser sowie nicht infektiöser Erkrankungen der Lunge. TLRs ermöglichen die Erkennung verschiedenster mikrobieller und viraler Muster, und die Aktivierung von TLRs stellt eine Vorraussetzung für die Einleitung von Abwehrmechanismen in Lungenmakrophagen dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren nach TLR-Aktivierung in humanen Lungenmakrophagen untersucht. Dabei ließen sich große Unterschiede zwischen Alveolarmakrophagen und interstitiellen Makrophagen feststellen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Alveolarmakrophagen eine effektive erste Abwehr von Pathogenen vermitteln, während interstitielle Makrophagen eher in regulatorische Prozesse involviert sind. Der anti-inflammatorische Faktor GILZ (glucocorticoid-induced leucine zipper) wird von Lungenmakrophagen stark exprimiert. Die Regulationsmechanismen, denen GILZ im Rahmen einer Entzündungsreaktion unterliegt, waren bisher jedoch unbekannt. Unsere Untersuchen zur Expression von GILZ in Alveolarmakrophagen zeigen erstmals, dass GILZ nach TLR-Aktivierung herabreguliert wird und liefern Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen. Die Aufklärung der Mechanismen, die in die Regulation von GILZ und TLR-Signalwegen involviert sind, kann zu einem besseren pathophysiologischen Verständnis und somit zu einer besseren Therapierbarkeit von entzündlichen Lungenerkrankungen beitragen.
2011-03-09
2017-07-12T07:27:12Z
2011-03-09
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-35546
hdl:20.500.11880/22753
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22697
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227562019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Effect of transmembrane potential on the diffusion of Na⁺/H⁺ exchanger of human red blood cell
Die Wirkung von Transmembranpotential auf die Diffusion von Na⁺/H⁺-Austauscher der menschlichen roten Blutzelle
Pasula, Aravind
Bernhardt, Ingolf
ddc:500
Blutzelle
Erythrozyt
Membranproteine
Diffusion
Na+/H+-Austauscher
Transmembranpotential
rote Blutzelle
Na+/H+ exchanger
transmembrane potential
red blood cell
The RBC membrane differs from a simple bilayer membrane by its mechanical properties, shear viscoelasticity and by the long range mobility of integral membrane proteins. The influence of transmembrane potential of human RBCs on the lateral diffusion of Na⁺/H⁺ exchanger and membrane lipid analogue Bodipy-HPC has been studied using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Variable changes in the diffusion constants of Na+/H+ exchanger at different transmembrane potentials and corresponding cytoskeleton interactions have been explained. The role of volume changes of RBCs on the diffusion constant of Na⁺/H⁺ has been studied. The obtained data suggest that the transmembrane potential has no significant influence on the lateral diffusion of lipid analogue Bodipy-HPC. Additionally, the mechanism behind the Ca²⁺ loss of a single Caco-2 cell in physiological conditions has been studied in detail. The mechanism behind such loss and the suitable inhibitor to block this loss has been studied. Different inhibitors for Ca²⁺ channels and pumps have been used to understand the responsible mechanism has been found out. It has been demonstrated, that the detached single Caco-2 cell, from the epithelium, loses Ca²⁺ through L-type channels. Moreover, the influence of nano-structured surfaces and nano-particles on the physiological processes like Ca²⁺ transport and intracellular pH of RBCs and Caco-2 cells has been studied. Changes in the intracellular pH and Ca²⁺ transport on living cells have impact on the cell metabolism and physiology. It has been shown that most of the surfaces with various patterns and textures on the glass surface do not influence the Ca²⁺ transport and intracellular pH. Polymer surfaces with different precursor material other than glass (borosilicate) have shown to exert significant influence on both Ca²⁺ transport and pH of RBCs and Caco-2 cells.
Die Membran der roten Blutzelle (RBC) unterscheidet sich von einer einfachen Bilayer-Membran durch ihre mechanischen Eigenschaften, viskoelastische Scherkräfte und durch die große Beweglichkeit von integralen Membranproteinen. Der Einfluss des Membranpotentials von menschlichen RBCs auf die laterale Diffusion des Na⁺/H⁺-Austauschers und des Membranlipid-Analogons bodipy-HPC wurde mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) untersucht. Die Variation der Diffusionskonstante des Na⁺/H⁺-Austauschers bei verschiedenen Transmembranpotentialen und den korrespondierenden Cytoskelett-Interaktionen wurde erklärt. Die Rolle von Volumenänderungen bei RBCs auf die Diffusionskonstante von Na⁺/H⁺ wurde studiert. Die gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass das Transmembranpotential keinen signifikanten Einfluss auf die laterale Diffusion des Lipid-Analogons bodipy-HPC hat. Zusätzlich wurde im Detail der Mechanismus hinter dem Ca²⁺-Verlust einer Caco-2-Zelle in physiologischen Bedingungen und einem geeigneten Inhibitor, um diesen Verlust zu blocken, untersucht. Verschiedene Inhibitoren für Ca²⁺-Kanäle und Pumpen wurden benutzt, um den verantwortlichen Mechanismus zu verstehen. Es wurde gezeigt, dass eine einzelne, aus Epithel isolierte, Caco-2-Zelle durch L-Typ-Kanäle Ca²⁺ verliert.Darüber hinaus wurde der Einfluss von nanostrukturierten Oberflächen und Nanopartikeln auf physiologische Prozesse wie den Ca²⁺-Transport und den intrazellulären pH von RBCs und Caco-2-Zellen betrachtet. Veränderungen im intrazellulären pH und dem Ca²⁺-Transport in lebenden Zellen haben einen Einfluss auf den Stoffwechsel und die Physiologie von Zellen. Es wurde gezeigt, dass die meisten nanostrukturierten Oberflächen mit verschiedenen Mustern und Texturen in der Glasoberflösche keinen Einfluss auf den Ca²⁺-Transport und den intrazellulären pH haben. Polymeroberflächen mit verschiedenen Rohstoffen als Glas (Borosilikat) zeigen einen signifikanten Einfluss sowohl auf den Ca²⁺-Transport als auch auf den pH von RBCs und Caco-2-Zellen.
2011-04-04
2017-07-12T07:27:12Z
2011-04-04
2010
2011-04-04
doc-type:doctoralThesis
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hdl:20.500.11880/22756
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22700
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227642019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
New models for telomerase inhibition by antisense 2'-O-methyl-RNA in lung cancer therapy
Neue Modelle zur Telomerase-Hemmung durch Antisense 2'-O-Methyl-RNA in der Lungenkrebs-Therapie
Dong, Meng
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Lungenkrebs
Telomerase
Nanopartikel
Antisense-Oligonucleotide
Inhibition
Telomer <Molekulargenetik>
Inhalation
Primäre Lungenzellen
Tumorgewebekultur
Rattenlungen-Perfusionsmodell
primary lung cells
tumor tissue culture
rat lung perfusion model
Telomerase activity can be detected in about 80% of non-small cell lung cancers (NSCLC). Inhibition of telomerase is a specific approach for treatment of NSCLC. The oligonucleotide 2'-O-methyl-RNA (OMR) binding to the RNA component of telomerase acts as a selective telomerase inhibitor. Chitosan-coated poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) nanoparticles which are capable to form nanoplexes with OMR are one promising carrier system for OMR delivery. This thesis is mainly focused on the therapeutic potential of OMR based on different in vitro and ex vivo models. In cell culture models, delivery of OMR by nanoparticles exhibited 50%-70% telomerase inhibition 72h after treatment. In A549 cells telomerase activity was continuously reduced by 80% and the telomere length shortened about 50% during a treatment for 102 days with nanoplexes. In a new tissue slice model, nanoplexes can penetrate into tumor tissue slices, deliver OMR and subsequently inhibit telomerase activity by about 40% without changing tissue architecture. An isolated perfused rat lung model was successfully applied to investigate the inhalative delivery of nanoplexes to the lung without altering lung physiology. In 40 NSCLC tumor samples, stem cell marker CD133 positive tumor cells tend to have a lower telomerase activity. These experiments provide evidence that telomerase inhibitors delivered by nanoparticles have a great potential for in vivo application to render a more selective anticancer therapy.
Etwa 80% aller nicht-kleinzelligen Lungentumoren (NSCLC) weisen Telomerase-Aktivität auf. Hemmung der Telomerase wäre eine spezifische Tumortherapie. Das Oligonukleotid 2'-O-Methyl-RNA (OMR) bindet an die RNA Komponente der Telomerase und ist ein selektiver Telomerase-Inhibitor. Chitosan beschichtete Polylaktat-coglykolat (PLGA)-Nanopartikel, die mit OMR Nanoplexe bilden, sind ein vielversprechendes Trägersystem. Diese Arbeit setzt verschiedene in vitro Modelle ein, um das therapeutische Potenzial von OMR zu untersuchen. Eine Nanopartikel-vermittelte Aufnahme von OMR in NSCLC Zelllinien und primäre humane Lungenkarzinomzellen führte nach 72 Stunden zu einer 50% bis 70%igen Hemmung der Telomerase. Eine 102-tägige Behandlung von A549 Zellen mit Nanoplexen reduzierte die Telomerase-Aktivität kontinuierlich um 80% und verkürzte die Telomere auf etwa 50%. Nanoplexe drangen in ex vivo kultiviertes Tumorgewebe ein. Die so eingeschleuste OMR hemmte die Telomerase-Aktivität um etwa 40%, ohne die Gewebe-Struktur zu verändern. Im Modell der isoliert perfundierten Rattenlunge wurden Nanoplexe inhalativ verabreicht, ohne die Lungenphysiologie zu verändert. OMR konnte in diesen Lungen nachgewiesen werden. In 40 NSCLC Proben zeigten die Tumorzellen mit positiver Expression des Stammzell-Markers CD133 eine Tendenz zu einer geringeren Telomerase-Aktivität. Diese Experimente zeigen, dass die Nanoplexe ein großes Potenzial für die in vivo Anwendung und eine selektivere Krebstherapie haben.
2011-05-12
2017-07-12T07:27:15Z
2011-05-12
2011
2011-05-13
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-39306
hdl:20.500.11880/22764
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22708
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227772019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Multilayer coating of gold nanoparticles (AuNP) with drug-polymer complex : development and characterization
Mehrfachbeschichtung von Goldnanopartikeln mit Wirkstoff-Polymerkomplex : Entwicklung und Charakterisierung
Reum, Nico
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Nanopartikel
Therapeutisches System
Photosensibilisator
Photodynamische Therapie
Polyelektrolyt
Goldnanopartikel
Wirkstoff-Polymerkomplex
gold nanoparticle
layer-by-layer
drug-polymer complex
Photosensitizers (PS) in combination with visible light are approved in photodynamic therapy for treatment of several types of cancer. Recent strategies for higher bioavailability and the reduction of side effects include PS loaded nanoparticle formulations. The subject of the present thesis is the development and characterization of gold based and surface modified nanoparticulate drug delivery systems for the PS 5,10,15,20-tetrakis(3-hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC) for intravenous administration. Gold nanoparticles (AuNP) with a diameter of 15 nm were prepared and used as template for the Layer-by-Layer (LbL) approach. The PS and the negatively charged polyelectrolyte (PE) poly(styrene sulfonate) sodium salt (PSS) were complexed with a new developed method using freeze-drying resulting in a dramatically increased water solubility of the PS. The phototoxicity of the PSS/mTHPC complex in water was increased compared to the free mTHPC in ethanol. A drug-multilayer system based on the LbL technique utilized the water-soluble complex as anionic layer material and poly(allylamine hydrochloride) (PAH) as cationic layer. For the first time, a nanoparticulate system with three adsorbed drug layers was prepared. The mTHPC-loaded modified AuNP were taken up by cells and the dark toxicity was strongly decreased. The mTHPC was released and effective as anticancer drug after illumination. In conclusion, the modified AuNP can be considered as promising carrier for such types of PS.
Photosensibilisatoren (PS) in Kombination mit sichtbarem Licht sind in der Photodynamischen Therapie zur Behandlung von Krebs zugelassen. Mit PS beladene Nanopartikel (NP) sind eine neue Strategie, um die Bioverfügbarkeit von PS zu erhöhen und Nebenwirkungen zu reduzieren. Das Thema dieser Doktorarbeit ist die Entwicklung und Charakterisierung von auf Gold (Au) basierten und oberflächenmodifizierten nanopartikulären Trägersystemen zur intravenösen Verabreichung des PS 5,10,15,20-Tetrakis(3-hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC). Es wurden AuNP (d = 15 nm) hergestellt, die als Vorlage für die Layer-by-Layer (LbL) Technik dienten. Der PS und das negativ geladene Poly(styrol sulfonat) Natriumsalz (PSS) wurden mit einer neuen Methode komplexiert, die eine starke Erhöhung der Wasserlöslichkeit von mTHPC zur Folge hatte. Die Phototoxizität vom PSS/mTHPC Komplex verglichen mit dem freien mTHPC war erhöht. Der Komplex wurde als negativ geladenes Schichtmaterial verwendet und Polyallylamin-hydrochlorid (PAH) als positives Schichtmaterial, um ein mehrschichtiges Wirkstoffsystem basierend auf der LbL Technik aufzubauen. Damit konnte erstmalig die Herstellung eines nanopartikulären Systems mit drei Wirkstoffschichten gezeigt werden. Die mit mTHPC beladenen und modifizierten AuNP wurden von Zellen aufgenommen und die Dunkeltoxizität wurde stark gesenkt. Das mTHPC wurde freigesetzt und war nach Bestrahlung wirksam gegen die Krebszellen. Zusammenfassend gesagt, sind die modifizierten AuNP ein vielversprechendes Transportsystem für diese Arten von PS.
2011-07-12
2017-07-12T07:27:19Z
2011-07-12
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-42086
hdl:20.500.11880/22777
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22721
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227812019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Synthese von hydrophoben Stärkederivaten und Pteroylamidhexylamin-funktionalisiertem Polyvinylalkohol zur Darstellung von Nanopartikeln zum gerichteten Wirkstofftransport
Synthesis of hydrophobic starch derivatives and pteroylamidhexylamin functionalized polyvinylalcohol for the formulation of nanoparticles for targeted drug delivery
Stauner, Thomas
Wenz, Gerhard
ddc:500
Stärkederivate
Folsäurederivate
Nanopartikel
Targeted drug delivery
starch derivatives
folic acid derivatives
nanoparticles
targeted drug delivery
In dieser Arbeit werden in einem ersten Schritt hydrophobe Stärkederivate (SD) mittels Veretherungs- und Veresterungsreaktionen nativer Stärke mit Halogenalkanen und Fettsäure-Estern dargestellt. Diese Derivate werden zur Darstellung von Nanopartikeln verwendet. In einem zweiten Schritt wird ein Folsäurederivat über einen Hexyldiaminlinker an Polyvinylalkohol (PVA) geknüpft und zur Darstellung von Nanopartikel verwendet. Weitere Gegenstände der Arbeit sind die Optimierung der einzelnen Syntheseschritte und eine Untersuchung der Einflüsse auf Synthese und Partikelformulierung. Eine Verkapselung der hydrophoben Wirkstoffe Taxotere® und Idarubicin® zeigt eine deutliche Steigerung der Löslichkeit gegenüber den unverkapselten Wirkstoffen. Es wird gezeigt, dass Nanopartikel mit folsäuremodifiziertem PVA eine verstärkte attraktive Wechselwirkung mit Folsäurerezeptoren exprimierenden Krebszellen eingehen als Partikel ohne diese Liganden. Auch kann eine günstige Freisetzung ohne den so genannten "burst effect", der schlagartigen Freigabe des Wirkstoffes, für Modellwirkstoffe, mit "burst effect" für Zytostatika wie Idarubicin® und Taxotere®, aufgezeigt werden. Die unbeladenen Partikel zeigen keine Zytotoxizität. Die Verwendung der hydrophoben, biokompatiblen Stärkederivate in Kombination mit zielgerichtetem Transport durch Verwendung von spezifischen Liganden verspricht die Verabreichung potenter hydrophober Wirkstoffe in geringeren Konzentrationen und damit mit geringeren Nebenwirkungen.
In this study starch derivatives (SD) were synthesized via etherification- and esterification reactions by the use of native starch, halogen alkanes and fatty acids as the first step of a drug delivery system. These derivatives were used for the formulation of nanoparticles. In the second step a folic acid derivative was coupled over 1,6-diaminhexane onto polyvinylalcohol (PVA) and this derivative was used for the formation of nanoparticles. The influences of the reaction conditions on the synthesis of the starch- and PVA-derivatives were examined and optimized. Also the influence of PVA on the formation of the nanoparticles was determined. The encapsulation of hydrophobic drugs as there is Taxotere® and Idarubicine® showed a significant increase of the solubility compared to the free drugs. It has been shown that nanoparticles made of folated PVA have an increased attractive interaction with cancer cells with folic acid receptors in contrast to such particles without folic acid ligands. Over and above that an auspicious release of the anti cancer drug over a longer period of time without a so called burst effect could be monitored. The unloaded particles themselves showed no cytotoxicity. The use of the hydrophobic biocompatible starch derivatives in combination with targeted delivery by the use of specific ligands promises the administration of highly potent and hydrophobic drugs in lower concentration und this way with fewer side effects.
2011-07-28
2017-07-12T07:27:20Z
2011-07-28
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-42354
hdl:20.500.11880/22781
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22725
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227902019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Gezielte Eingriffe in die Steroidbiosynthese durch CYP Inhibitoren zur Entwicklung neuartiger Therapeutika für die Behandlung von Prostatakarzinom und Metabolischem Syndrom
CYP inhibitors for the development of new drugs for the treatment of prostate cancer and metabolic syndrome
Hille, Ulrike E.
Hartmann, Rolf
ddc:500
Hormonrefraktärer Prostatakrebs
Metabolisches Syndrom
CYP Inhibitoren
CYP inhibitors
postate cancer
An der menschlichen Steroid-Biosynthese sind sechs CYP Enzyme beteiligt. Vier davon stellen sehr interessante Targets zur Entwicklung neuer Medikamente für die Therapie einer Reihe von hormonabhängigen Krankheiten dar. In dieser Arbeit wurden zwei Targets ausgewählt, zum einen das Schlüsselenzym der Androgenbiosynthese, CYP17, und zum anderen CYP11B1, welches den entscheidenden Schritt in der Cortisolbiosynthese darstellt. Design und Synthese der vorgestellten CYP17 Inhibitoren, die zur Therapie des hormonabhängigen Prostatakarzinoms dienen können, wurden ausgehend von bekannten biphenylischen Grundstrukturen entwickelt. Die dabei entstandenen Inhibitoren konnten, mit IC50 Werten bis zu 52 nM, sowohl bezüglich ihrer Aktivität zum Target CYP17 als auch hinsichtlich ihrer Selektivität gegenüber einer Reihe von weiteren CYP Enzymen stark optimiert werden. Die vorgestellten CYP11B1 Inhibitoren wurden ausgehend von einem Etomidat-basierten Design Konzept entwickelt. Die so gefundenen CYP11B1 Inhibitoren stellen die ersten selektiven Hemmstoffe dieses Enzyms dar. Eine besondere Herausforderung bei der Optimierung dieser Verbindungen war die Selektivität zum mit 93 % hochhomologen CYP11B2. Mit bis zu 49facher Selektivität gegenüber CYP11B2 und gleichzeitig hoher Hemmaktivität gegenüber CYP11B1 mit IC50 Werten im bis zu einstelligen nanomolaren Bereich war der durchgeführte Ansatz erfolgreich. Nach erweiterten pharmakologischen Untersuchungen und gegebenenfalls erforderlichen strukturellen Optimierungen sollen aus den vorgestellten Substanzklassen Entwicklungskandidaten hervorgehen.
Six CYP enzymes are involved in human steroid biosynthesis. Four of them constitute very interesting targets for the development of new drugs in order to treat a variety of hormone-dependent diseases. Herein, two targets were selected: on the one hand, CYP17, the key-enzyme in androgen biosynthesis and on the other hand CYP11B1, catalyzing the main step in cortisol biosynthesis. Design and synthesis of the investigated CYP17 inhibitors, which should be promising drugs in the treatment of hormone dependent prostate cancer were developed outgoing from known biphenylic core-structures. Optimization of these compounds yielded inhibitors with IC50 values as low as 52 nM, which showed strong activity toward the target CYP17 as well as high selectivity toward a broad range of further CYPs. The herein presented CYP11B1 inhibitors were developed outgoing from an etomidate-based design concept and are the first selective inhibitors of this enzyme. Particularly challenging was the optimization of these compounds regarding their selectivity toward the 93 % homologuos CYP11B2. With up to 49fold selectivity toward CYP11B2 and at the same time high inhibitory activity toward CYP11B1 in the low nanomolar range, the development was successful. In conclusion, after extended pharmacological testing, and, if required, further structural optimisation, the presented class of substances should give rise to new developmental candidates.
2011-08-26
2017-07-12T07:27:23Z
2011-08-26
2010
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-40945
hdl:20.500.11880/22790
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22734
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227912019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Nicht invasive Charakterisierung von Differenzierungsprozessen in humanen Stammzellen
Non invasive characterization of differentiation processes in human stem cells
Hildebrandt, Cornelia
Fuhr, Günter R.
ddc:500
Impedanzspektroskopie
Akustische Mikroskopie
Stammzelle
mesenchymale Stammzellen
humane embryonale Stammzellen
osteogene Differenzierung
impedance spectroscopy
acoustic microscopy
mesenchymal stem cells
human embryonic stem cells
osteogenic differentiation
Gegenstand dieser Arbeit war die vergleichende Charakterisierung der osteogenen Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark (BM-MSCs), dem Fettgewebe (AT-MSCs) und dem Nabelschnurblut (CB-MSCs) mit der humanen embryonalen Stammzelllinie hES H1 in 2D und 3D in vitro Kulturen. Weiterhin wurde evaluiert, ob man Differenzierungsprozesse mit nicht invasiven Verfahren bestimmen kann. Die Charakterisierung der Stammzellen in 2D demonstrierte ein hohes osteogenes Potential in allen mesenchymalen Stammzellpopulationen, allerdings war das replikative Potential der CB-MSCs stark eingeschränkt. Für die osteogene Differenzierung der Stammzellen wurde ein trägerfreies 3D in vitro Modell (Sphäroid) etabliert. In diesem Modellsystem war es nicht möglich, die osteogene Differenzierung der hES H1-Zellen zu induzieren, obwohl diese Zellen in 2D-Zellkulturen erfolgreich in Osteoblasten differenzierbar waren. Die Untersuchung der Sphäroide mittels Impedanzspektroskopie demonstrierte charakteristische Veränderungen der Spektren infolge des Differenzierungs-prozesses. Die Heterogenität der osteogenen Sphäroide nahm mit fortschreitender Differenzierung zu, wobei AT-MSCs schneller differenzierten als BM-MSCs. Zelluläre Strukturen sowie fibrilläre ECM und deren Kalzifizierung wurden mittels akustischer Mikroskopie in 2D-Kulturen abgebildet. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die mechanischen Eigenschaften der Zellkulturen spezifisch für multipotente Differenzierungsprozesse waren.
The purpose of this study was a comparative characterization of the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow (BM-MSCs), adipose tissue (ATMSCs) and cord blood (CB-MSCs) and the human embryonic stem cell line hES H1 in 2D and 3D in vitro cultures. For the investigation of the differentiation process, non-invasive techniques were implemented and evaluated. The basic characterization of the stem cell cultures demonstrated a high osteogenic potential in all mesenchymal stem cell populations, but a reduced replicative capacity was shown in CB-MSCs. A self-contained 3D in vitro model (spheroid) for the osteogenic differentiation of the stem cells was established. In this in vitro model, it was not possible to induce osteogenic development of hES H1, while in 2D-cultures these cells differentiated into the osteogenic lineage successfully. The investigation of the spheroids by impedance spectroscopy demonstrated characteristic changes in the recorded spectra. The heterogeneity of the spheroids increased according to the differentiation process at which AT-MSCs differentiated faster than BM-MSCs. Acoustic microscopy aimed in investigation of differentiation processes in monolayer cultures detecting cell structures as well as fibres of ECM and its mineralization. Further, specific changes in the mechanical properties of these cells were demonstrated related to multipotent differentiation processes.
2011-08-30
2017-07-12T07:27:24Z
2011-08-30
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-43082
hdl:20.500.11880/22791
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22735
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227922019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Exploiting the natural products of novel myxobacteria : phylogenetic and fatty acid perspectives and bioactive compound discovery
Die Ausnutzung von Naturstoffen neuer Myxobakterien : Perspektiven bei Phylogenie und Fettsäuren und das Entdecken bioaktiver Substanzen
Garcia, Ronald O.
Müller, Rolf
ddc:500
Myxobakterien
Fettsäuren
Phylogenie
Sekundärmetabolite
Naturstoffe
myxobacteria
fatty acids
phylogeny
secondary metabolites
natural products
Myxobacteria synthesise diverse and interesting secondary metabolites with impressive biological activities and modes of action. In an effort to uncover new bioactive compounds, world-wide samples were explored using various cultivation and isolation techniques. Several novel isolates were successfully cultivated representing a new family (Phaselicystidaceae) and new genera (Phaselicystis, Aetherobacter, Minicystis, Pseudochondromyces). Based on 16S rRNA gene sequence analysis, they appear to represent the so-far "uncultivated'; group of myxobacteria. During the chemical characterisation of novel isolates, large quantities of commercially valuable polyunsaturated fatty acids (PUFAs) were detected by GC-MS analysis. Eight PUFAs, comprising different ω-3 and ω-6 fatty acids (FAs), were identified for the first time in myxobacteria. Based on FA and 16S rRNA gene analyses, myxobacteria were again proven to be a coherent group. This finding not only pioneers the chemo-phylogenetic correlation of myxobacteria but also aids in the identification of potentially new PUFA-producing strains. The study also highlights the discovery of new bioactive compounds in the novel species Aetherobacter rufus SBSr003T. Semi-preparative HPLC separations yielded two novel bioactive compounds. Ongoing NMR analysis will enable elucidation of the compounds'; structures. Overall, myxobacteria were exemplified as model organisms for many wide and promising applications.
Myxobakterien synthetisieren vielfältige und interessante Sekundärmetabolite mit beeindruckenden biologischen Aktivitäten und Wirkmechanismen. Auf der Suche nach neuen bioaktiven Verbindungen wurden Proben aus der ganzen Welt mittels unterschiedlicher Kultivierungs- und Isolierungstechniken erforscht. Einige neue Isolate wurden erfolgreich kultiviert und repräsentieren neue Familien (Phaselicystidaceae) und neue Gattungen (Phaselicystis, Aetherobacter, Minicystis, Pseudochondromyces). 16S-rRNA-Gensequenzanalysen ergaben, dass sie die bisher "unkultivierte" Gruppe von Myxobakterien zu vertreten scheinen. Bei der chemischen Charakterisierung der neuen Isolate mittels GC-MS-Analyse wurden große Mengen mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFAs) von hohem kommerziellem Wert nachgewiesen. Acht PUFAs, die verschiedene ω-3 und ω-6 Fettsäuren (FAs) umfassen, wurden erstmals in Myxobakterien identifiziert. Bei FA-Analysen und 16S-rRNA-Gensequenzanalysen erwiesen sich die Myxobakterien abermals als einheitliche Gruppe. Diese Feststellung bereitet nicht nur den Weg für die chemo-phylogenetische Zuordnung der Myxobakterien, sondern hilft ferner dabei potenzielle neue Stämme, die PUFAs produzieren, zu identifizieren. Die vorliegende Arbeit hebt auch die Entdeckung neuer bioaktiver Verbindungen aus der neuen Art Aetherobacter rufus SBSr003T hervor. Mittels semi-präparativer HPLC-Auftrennungen wurden zwei neuartige bioaktive Verbindungen gewonnen. NMR-Analysen ermöglichen derzeit die Strukturaufklärung dieser Verbindungen. Insgesamt wurde veranschaulicht, dass Myxobakterien als Modelorganismen für viele umfangreiche und vielversprechende Anwendungen dienen können.
2011-09-08
2017-07-12T07:27:25Z
2011-09-08
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-43254
hdl:20.500.11880/22792
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22736
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227932019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Erweiterung der Testplattform zur Charakterisierung von Aldosteronsynthase-Inhibitoren unter besonderer Berücksichtigung von Speziesunterschieden
Upgrading the test platform for characterisation of aldosterone synthase inhibitors with special focus on species differences
Zimmer, Christina
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Organkultur
Chronische Herzinsuffizienz
Aldosteron
Synthasen
Inhibitor
Aldosteronsynthase
Steroid-11beta-Hydroxylase
Speziesunterschiede
congestive heart failure
aldosterone synthase
steroid-11beta-hydroxylase
species differences
Das Enzym Aldosteronsynthase (CYP11B2) stellt ein innovatives Target dar, durch dessen Beeinflussung die Behandlung Aldosteron-abhängiger Erkrankungen, im Vergleich zur derzeit verfügbaren Therapie, deutlich verbessert werden könnte.
3-Pyridin substituierte Naphthalene konnten als potente Leitverbindungen identifiziert werden, die CYP11B2 in vitro effektiv inhibieren und die Aktivität des hoch homologen CYP11B1-Enzyms deutlich weniger beeinflussen. Diese Substanzen weisen jedoch unerwünschte Wechselwirkungen mit hepatischen CYP-Enzymen auf und sind nicht in der Lage die Aldosteronbiosynthese in vivo in der Ratte zu hemmen. In der vorliegenden Arbeit wurden mehr als 100 neuartige Hemmstoffe durch Ligand- und Struktur-basiertes Design entwickelt, synthetisiert und auf biologische Aktivität und Selektivität getestet. Darüber hinaus wurden weitere in vitro Testsysteme etabliert, die es erlauben potentielle Kandidaten zur Erbringung des Proof of Principle und des Proof of Concept im Rattenmodell zu identifizieren. Die meisten der hierin vorgestellten Verbindungen sind hochpotente CYP11B2-Inhibitoren mit IC50-Werten im nano- bis picomolaren Bereich mit hoher Selektivität gegenüber anderen steroidogenen CYP-Enzymen. Außerdem weisen die vielversprechenden Hemmstoffe ein deutlich verbessertes pharmakologisches Gesamtprofil gegenüber den entsprechenden Naphthalenderivaten auf. Des Weiteren konnte eine "rattenaktive" Substanz in vitro identifiziert und eine signifikante Absenkung der Plasma-Aldosteronspiegel in vivo gezeigt werden. Nach erweiterten pharmakologischen Untersuchungen und gegebenenfalls erforderlichen strukturellen Optimierungen sollen aus den vorgestellten Substanzklassen Wirkstoffkandidaten für die präklinische Prüfung hervorgehen.
The enzyme aldosterone synthase (CYP11B2) is an innovative target, that could improve the treatment of aldosterone-mediated disorders significantly compared to standard therapy. 3-Pyridine substituted naphthalenes were identified as potent lead compounds, which are in vitro highly potent CYP11B2 inhibitors with a pronounced selectivity against the highly homologous CYP11B1 enzyme. These early leads exhibit several major pharmacological drawbacks, above all undesirable hepatic CYP interactions and lacking in vivo activity in rats. The optimization process described in this thesis yielded more than 100 new compounds, developed in a combined ligand- and structure-based approach. Further in vitro test systems were established in order to identify potential candidates to investigate the Proof of Principle and the Proof of Concept in a rat model. Most of the herein described compounds are highly potent CYP11B2 inhibitors with IC50 values in the low nanomolar to picomolar range and an excellent selectivity against other steroidogenic CYP enzymes. The most promising compounds of the present study show an improved pharmacological profile compared to the corresponding naphthalene derivatives. Furthermore a "rat-active'; compound was identified in vitro and evaluated for its ability to decrease plasma aldosterone levels in rats. The compound of the dihydro-1H-quinolin-2-one series exerts potent aldosterone-lowering effects in vivo using an ACTH stimulated rat model. In conclusion, after further optimization and pharmacological evaluation the current work might give rise to a drug candidate for preclinical testing.
2011-09-14
2017-07-12T07:27:25Z
2011-09-14
2010
2011-09-14
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-43265
hdl:20.500.11880/22793
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22737
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227972019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Ultra high performance liquid chromatographic-tandem mass spectrometric multi-analyte approach for target screening and quantification in human blood plasma : development, validation, and application
Ultra Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandemmassenspektrometrie Multi-Analytmethode für Targetscreening und Quantifizierung in humanem Blutplasma : Entwicklung, Validierung und Anwendbarkeit
Remane, Daniela
Maurer, Hans H.
ddc:500
LC-MS
Tandem-Massenspektrometrie
Blutplasma
Validierung
Neuroleptikum
Antidepressivum
Multi-Analytverfahren
UHPLC
LC-MS/MS
multi-analyte
benzodiazepine
In the presented studies, the development of an UHPLC-MS/MS approach for fast target screening and quantification in plasma was described. This approach covered 136 analytes out of the drug classes of antidepressants, neuroleptics, benzodiazepines, beta-blockers, oral antidiabetics, and analytes to be determined in the context of brain death diagnosis. Further, it was possible to find one chromatographic system with the same column and mobile phase compositions to separate almost all these analytes sufficiently. A fast and simple liquid-liquid extraction for all these analytes was developed. In addition, the presented studies showed that ion suppression and enhancement tests were essential, particularly for the selection of internal standards for UHPLC-MS/MS multi-analyte procedures and for combining co-eluting analytes during method validation. Furthermore, this approach was fully validated for the most important drug classes of antidepressants, neuroleptics, and benzodiazepines. This approach was valid for 28 antidepressants, 24 neuroleptics, and 21 benzodiazepines. In addition, the applicability was shown successfully using authentic human blood samples and external quality control samples. The cost and time saving one-point calibration was shown to be sufficient for more than half of the analytes.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Entwicklung einer UHPLC-MS//MS Methode für schnelles Target-Screening und Quantifizierung im Plasma beschrieben. Die Methode umfasste 136 Arzneistoffe aus den Stoffgruppen der Antidepressiva, Neuroleptika, Benzodiazepine, Betablocker, orale Antidiabetika und Arzneistoffe, die im Rahmen der Hirntoddiagnostik untersucht werden müssen. Weiterhin war es möglich, ein chromatographisches System, unter Verwendung derselben Säule und Fließmittelzusammensetzung, für die Trennung aller Arzneistoffe zu finden. Eine schnelle und einfache Flüssig-Flüssig-Extraktion wurde für alle Arzneistoffe entwickelt. Die Notwendigkeit von Untersuchungen zur Ionenunterdrückung und Ionenerhöhung konnte ebenfalls in dieser Arbeit belegt werden. Diese Untersuchungen waren für die Wahl des internen Standards für LC-MS/MS Methoden und für die Zusammensetzung von co-chromatographierenden Stoffen wichtig. Weiterhin wurde diese Methode für die wichtigsten Stoffgruppen nämlich die Antidepressiva, Neuroleptika und Benzodiazepine voll validiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Methode für 28 Antidepressiva, 24 Neuroleptika und 21 Benzodiazepine valide war. Die Anwendbarkeit wurde mittels humaner authentischer Plasmaproben und mittels externen Qualitätskontrollproben gezeigt. Die kosten- und zeitsparende Ein-Punkt-Kalibrierung erwies sich für über die Hälfte der Arzneistoffe als akzeptabel.
2011-10-14
2017-07-12T07:27:26Z
2011-10-14
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-43431
hdl:20.500.11880/22797
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22741
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/227992019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Deciphering novel mechanisms of bacterial secondary metabolite biosynthetic pathways
Aufklärung neuartiger Mechanismen in Biosynthesewegen bakterieller Sekundärmetabolite
Pistorius, Dominik
Müller, Rolf
ddc:500
Biosynthese
Polyketid-Synthasen
Antibiotikum
Sekundärmetabolit
Pseudomonas aeruginosa
Stigmatella aurantiaca
Quorum sensing
Aurachin
Quorum sensing
Pseudomonas aeruginosa
Stigmatella aurantiaca
Aurachin
Bacterial secondary metabolites display enormous structural diversity with astonishing biological activities. This thesis confers new insights into the biosynthesis of the myxobacterial secondary metabolites tubulysins by both in vitro and in vivo experiments, along with the identification and characterization of new structural variants.
The cryptic biosynthetic pathway of the aurachins in Stigmatella aurantiaca Sg a15 was elucidated. In vitro experiments revealed an unparalleled priming mechanism for the anthranilate starter unit. In vivo gene inactivation experiments resulted in the identification of the tailoring functionalities responsible for the successive transformations from aurachin D to aurachin A.
Another topic of this thesis was the investigation of the biosynthesis of 2-heptyl-4(1H)-quinolone (HHQ), an important quorum sensing molecule in Pseudomonas aeruginosa. In vitro reconstitution of HHQ biosynthesis by employing recombinant PqsD protein has shed light on this enzyme and its substrates, leading to the development of an in vitro test system for the identification of HHQ biosynthesis inhibitors, a promising alternative target in P. aeruginosa therapy.
Exploiting the newly sequenced genome of S. aurantiaca Sg a15 a genome mining approach, combining targeted gene inactivation with a statistics based comparative secondary metabolite profile analysis, was adapted and employed. This culminated in the identification and characterization of the rhizopodin biosynthetic gene cluster.
Von Bakterien produzierte Sekundärmetabolite weisen enorme strukturelle Diversität und erstaunliche biologische Aktivitäten auf. Diese Arbeit gewährt neue Einblicke in die Biosynthese der myxobakteriellen Sekundärmetabolitfamilie der Tubulysine durch in vitro und in vivo Experimente zusammen mit der Identifizierung und Charakterisierung neuer struktureller Varianten.
Die komplizierte Biosynthese der Aurachine in Stigmatella aurantiaca Sg a15 wurde aufgeklärt. In vitro Experimente legten einen einmaligen Mechanismus zur Bereitstellung der Anthranilsäure Startereinheit offen und in vivo Inaktivierungsexperimente resultierten in der Identifizierung der modifizierenden Enzyme, die für die schrittweise Umwandlung von Aurachin D zu Aurachin A verantwortlich sind.
Ein weiterer Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung der Biosynthese von 2 Heptyl-4(1H)-chinolin (HHQ), ein wichtiges Quorum sensing Molekül in Pseudomonas aeruginosa. Die Rekonstruktion der HHQ-Biosynthese in vitro mittels rekombinantem PqsD Protein gab Aufschluss über dieses Enzym und seine Substrate und führte zur Entwicklung eines in vitro Testsystems zur Identifizierung von Inhibitoren der Biosynthese von HHQ, ein vielverspechendes alternatives Angriffsziel für die Therapie von Infektionen mit P. aeruginosa.
Das kürzlich sequenzierte Genom von S. aurantiaca Sg a15 wurde für einen „Genome mining“ Ansatz genutzt. Dieser setzt sich zusammen aus der gezielten Inaktivierung bestimmter Gene und einer statistikgestützten vergleichenden Analyse der Sekundärmetabolitprofile. Dadurch konnte der Biosynthesegencluster von Rhizopodin identifiziert und charakterisiert werden.
2011-10-31
2017-07-12T07:27:27Z
2011-10-31
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-44088
hdl:20.500.11880/22799
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22743
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228062019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Interaction of nanoscale particles with the skin barrier
Interaktion der Nanopartikel mit der Hautbarriere
Labouta, Hagar Ibrahim Mohamed Ibrahim
Schneider, Marc
ddc:500
Nanopartikel
Gold
Kolloides Metall
Interaktion
Haut
Penetration
kolloidales Gold
Multiphotonenmikroskopie
nanoparticle
nanoparticle penetration
skin penetration
gold nanoparticles
multiphoton microscopy
Skin penetration of nanoparticles was the focus of several recent studies. This is of major importance in basic research for potential future applications, e.g. designing topical and transdermal delivery systems, as well as for health risk analysis. Yet, there is a controversy among researchers on the status of their skin penetration due to different experimental setups. Meanwhile, there is little known about the mechanism and determinants of nanoparticle penetration.
The main thesis objective was hence to study the penetration of model gold nanoparticles of different physicochemical and formulation parameters through human skin of different degrees of barrier integrity. Multiphoton microscopy was used for nanoparticle detection. Imaging parameters were determined in terms of resolution and depth profiling of gold nanoparticles in skin. A semiquantitative approach based on pixel analysis of gold nanoparticles was developed to compare nanoparticle localization in different skin locations under different conditions. Based on penetration experiments, determinants that favor or limit particle penetration were determined as well as the barrier to penetration (intercellular lipids). Finally nanoparticle penetration was successfully enhanced using a chemical enhancement approach.
Results obtained are important to enhance our understanding of nanoparticle interaction with the skin barrier. Future studies are required to reduce the gap between research and applications.
Die Penetration von Nanopartikeln ist Gegenstand der aktuellen Forschung. Diese Frage ist von großer Bedeutung für die Anwendung im Bereich der Nanomedizin als auch für die Abschätzung des Risikopotenzials bei Kontakt mit solchen Systemen. Bis dato sind allerdings keine eindeutigen Aussagen möglich. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung des Penetrationsverhaltens anhand von kolloidalem Gold (AuNP). Dieses Modellsystem erlaubt die Untersuchung der Penetration in Abhängigkeit von verschiedenen physikochemischen Eigenschaften der Partikel (oberflächenmodifiziert), als auch von Formulierungseigenschaften (Vehikel). Die AuNP erlauben eine Visualisierung mittels Multiphotonen Mikroskopie. Daher wurden die Auflösung und die optischen Parameter für AuNP in Haut bestimmt. Des Weitern wurde ein Pixel-basiertes Verfahren ermittelt, das eine semiquantitative Analyse der penetrierten Objekten ermöglicht. Dies erlaubt eine Abschätzung der Partikelpenetration. Penetrationsexperimente erlaubten die Parameter, die die Penetration beeinflussen, hinsichtlich Größe und Oberflächenpolarität einzuschränken. Außerdem konnte gezeigt werden, dass auch die Penetration von Nanopartikeln mit Hilfe von Penetrationsverbesserern gesteigert werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind wichtige Bausteine für das Verständnis der Interaktion von Nanopartikeln mit der Hautbarriere. Zukünftige Studien sind dennoch nötig, um die Lücke zwischen Forschung und möglicher Anwendung zu schließen.
2011-12-20
2017-07-12T07:27:29Z
2011-12-20
2011
2011-12-20
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45313
hdl:20.500.11880/22806
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22750
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228072019-01-10T07:43:20Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Studies on the biosynthesis and heterologous expression of tubulysin
Untersuchungen zur Biosynthese und heterologe Expression von Tubulysin
Chai, Yi
Müller, Rolf
ddc:500
Biosynthese
Heterologe Genexpression
Sekundärmetabolit
Tubulysin
heterologe Expression
tubulysin
biosynthesis
heterologous expression
The tubulysins are a family of nine complex peptides with promising cytotoxic activity against multi drug-resistant tumors. This thesis reports a third tubulysin producing strain, Cystobacter sp. SBCb004. Although the tubulysin biosynthetic gene clusters appear to be incomplete in both SBCb004 and An d48, comparison of the clusters reveals a conserved 11-gene architecture, which allowed the assignment of cluster boundaries. Knockout mutagenesis and in vitro assay of genes located at both ends of the conserved cluster revealed their involvement and possible functions in the tubulysin pathway. Pretubulysin was identified from both natural producer strains, confirming its intermediacy in the pathway. Using a combination of feeding studies and high-resolution tandem mass spectrometry, An d48 and SBCb004 were found to biosynthesize 32 additional tubulysin derivatives. Using Red/ET recombineering, the entire tubulysin core gene cluster from strain SBCb004 was reconstituted and successfully expressed in heterologous host strains Pseudomonas putida and Myxococcus xanthus. Finally, BLAST analysis of the SBCb004 genome data was carried out to identify candidate monooxygenases, whose involvements in tubulysin assembly were evaluated using a combination of knockout mutagenesis and heterologous expression.
Tubulysine stellen eine Familie von neun komplexe Peptiden dar, welche viel versprechende zytotoxische Eigenschaften gegen multiresistente Tumore aufweisen. In dieser Arbeit wird ein dritter Stamm beschrieben, welcher Tubulysine produziert (Cystobacter sp. SBCb004). Obwohl die Tubulysin-Biosynthesegencluster aus SBCb004 und An d48 unvollständig erscheinen, zeigt ein Vergleich der Gencluster eine konservierte Architektur von elf Genen auf, wodurch die Grenzen des Clusters definiert werden konnten. Über Geninaktivierungsstudien und in vitro Assays konnte die Beteiligung und mögliche Funktion von Genen, welche an beiden Enden der Gencluster in konservierter Form gefunden wurden, aufgezeigt werden. Prätubulysin wurde in den Extrakten beider natürlichen Produzentenstämme identifiziert und so als Biosyntheseintermediat bestätigt. Zudem wurde basierend auf der Kombination von hochauflösender Massenspektrometrie und Fütterungsexperimenten nachgewiesen, dass An d48 und SBCb004 zusammen 32 zusätzliche Tubulysinderivate herstellen. Der Tubulysin-Biosynthesegencluster aus Stamm SBCb004 ausgehend mittels Red/ET Recombineering rekonstituiert und dann heterolog in Pseudomonas putida und Myxococcus xanthus exprimiert. BLAST Analysen des Genoms von SBCb004 zeigten die Präsenz von multiplen Monooxygenasen auf, deren Beteiligung an der Tubulysinbiosynthese durch eine Kombination von Inaktivierungsmutagenese und heterologer Expression studiert wurde.
2011-12-06
2017-07-12T07:27:29Z
2011-12-06
2011
2011-12-22
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45194
hdl:20.500.11880/22807
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22751
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228092019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Entwicklung und Validierung eines miniaturisierten in vitro Systems zur Erfassung nanopartikulärer und viraler Effekte auf zellulärer Ebene
Development and evaluation of a miniaturized in vitro system for investigating nanoparticulate and viral effects on the cellular level
Kohl, Yvonne
Fuhr, Günter R.
ddc:500
Nanopartikel
Cytotoxizität
Viren
In-vitro-Kultur
Miniaturisierung
Chip
Europäische Union / REACH-Verordnung
Nanopartikel
Inflammation
Mikrokavität
miniaturisiertes In-vitro-System
Zytotoxizität
nanoparticle
inflammation
micro cavity
miniaturized in vitro system
cytotoxicity
Ein Schwerpunkt der EU-Chemikalienverordnung REACH ist die Förderung alternativer Testmethoden zur Risikobewertung chemischer Stoffe. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Entwicklung und Validierung eines miniaturisierten in vitro Systems zur Untersuchung nanopartikulärer und viraler Effekte auf zellulärer Ebene als neue Screeningmethode zur Bewertung des toxischen Potenzials nanoskaliger Materialien.
Dazu wurde ein Arraysystem mit miniaturisierten Zellkulturgefäßen entwickelt, in denen eine kleine, aber statistisch signifikante Zellzahl kultiviert und zelluläre Reaktionen erfolgreich in vitro charakterisiert werden konnten.
Es konnte gezeigt werden, dass sich die Miniaturisierung nicht negativ auf das Zellverhalten auswirkt. Somit wurde das neue in vitro System erfolgreich als System zur nanotoxikologischen nichtinvasiven Echtzeitanalyse individueller adhärenter Zellen einer definierten Population evaluiert. Nachdem die Sensitivität des entwickelten mikrokavitätenchip (MKC)-basierten in vitro Systems gegenüber den bisher angewendeten Methoden bewiesen werden konnte, wurde zur weiteren Systemevaluierung der Effekt der Miniaturisierung auf summarische Prozesse wie z. B. die Stammzelldifferenzierung untersucht.
Die Anwendung des MKC-basierten Systems zur Untersuchung nanopartikulärer und viraler Effekte auf die Differenzierung und die Inflammation individueller Zellen konnte erfolgreich gezeigt werden. Das neue System eignet sich daher zur Risikobewertung im Rahmen von REACH.
One main focus of the European Regulation of chemical substances REACH is the support of alternative test methods for the risk assessment of chemical substances. Hence, the goal of this dissertation was the development and evaluation of a miniaturized in vitro system for investigating nanoparticulate and viral effects on the cellular level as new screening method for assessing the toxic potential of nanoscaled materials.
Therefore, an array system with miniaturized cell culture chambers has been established, in which a small but statistically significant cell number could be cultured and cellular reactions could be successfully characterized in vitro.
No negative effect of miniaturi¬zation on the cell behavior could be indicated. Therefore the new in vitro system was successfully evaluated as system for noninvasive nanotoxicological real time analysis of individual adherent cells in a defined population.
After verifying the sensitivity of the established micro cavity chip (MCC)-based system compared to previously applied methods the effect of miniaturization on summary processes like the stem cell differentiation had been investigated for further validation of the system. The application of the MCC-based system for investigating nanoparticulate and viral effects on the differentiation and the inflammation of individual cells could be shown successfully. Thus the new system is suitable for risk assessment in the framework of REACH.
2011-12-13
2017-07-12T07:27:30Z
2011-12-13
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45245
hdl:20.500.11880/22809
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22753
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228202019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Multifunktionalisierte magnetische Nanopartikel als Drug-Delivery Systeme
Multi-functionalized magnetic nanoparticles as drug-delivery systems
Prinz, Eva-Marie
Hempelmann,Rolf
ddc:500
Targeted drug delivery
T-Lymphozyt
Magnetische Flüssigkeit
Ferrofluide
adoptive Immuntherapie
Layer-by-Layer-Verfahren
drug targeting
ferrofluide
adoptive immunotherapy
T-cells
layer-by-layer-technique
Der Schwerpunkt dieser Dissertation ist die Synthese von multifunktionalen, magnetischen Nanopartikelen für biomedizinische Anwendungen. Hierbei werden die Nanopartikel der Stöchiometrie Mn0,8Zn0,2Fe2O4 durch kontrollierte Fällung der entsprechenden Metallchloride in Natronlauge synthetisiert. Anschließend wird deren Oberfläche durch verschiedene Verfahren mit ausgewählten biokompatiblen Polymeren beschichtet und mit Doxorubicin, einem Chemotherapeutikum, funktionalisiert. Daran anschließend wird das Potential dieser Doxorubicin-funktionalisierten magnetischen Nanopartikel in-vitro für den Einsatz in der adoptiven Krebsimmuntherapie getestet. Als erstes wird Dextran zur Oberflächenmodifizierung der MnZn-Ferrite verwendet. Durch entsprechende Funktionalisierung mittels Aldehyd-, Carboxymethyl- oder Amino-Gruppen kann Dextran aktiviert und Doxorubicin angebunden werden. Die erfolgreiche Anbindung Doxorubicins an die beschichteten Partikel wird mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS), Fluoreszenz-Korrelations-, Raman-, FT-IR-, UV/Vis- und Fluoreszenz-Spektroskopie, sowie Zetapotential-Messungen nachgewiesen. Die anschließende Aufnahme der wirkstoffbeladenen Partikeln in die Immunzellen (T-Lymphozyten) wird mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie und TEM-Aufnahmen nachgewiesen. Die Aktivität dieser Wirkstoff-funktionalisierten Partikel auf Krebszellen wird mit Hilfe von SRB- und MTT-Assays nachgewiesen. Die Layer-by-Layer-Technik (LbL-Technik) stellt ein weiteres Verfahren dar, welches zur Oberflächenmodifizierung der magnetischen Nanopartikel herangezogen wird. Das LbL-Verfahren bietet nicht nur die Möglichkeit die Schichtdicke zu variieren, sondern ebenfalls durch Variation der ausgewählten Polyelektrolyte (Polyarcylsäure (PAA), Polyallylamin (PAH), Polyethylenimin (PEI) und Poly(4-styrolsulfonsäure)-co-Maleinsäure (PSSa-co-MA)), können diverse Wirkstoffe bzw. Biomoleküle in das Multischichtsystem einzubauen. Durch geschützten Wirkstofftransport kann die Überlebensrate der T-Zellen effektiv gesteigert werden und damit verbunden das Zeitfenster, in dem die Wirkstoff-beladenen T-Zellen ihren Zielort (z. B. Krebszellen oder Tumore) erreichen können. Der Aufbau von Multischichten auf der Partikeloberfläche wird mittels DLS, FT-IR-Spektroskopie sowie TEM-Aufnahmen erfolgreich nachgewiesen. Es stellt sich heraus, dass das Multischichtsystem, bestehend aus PAH und PAA sowie aus PEI und PSSa-co-MA, optimale Voraussetzungen für eine anschließende Funktionalisierung mit Doxorubicin liefert. Je nach dem welcher Polyelektrolyt die äußerste Schicht des Multischichtsystems bildet, erfolgt die Anbindung von Doxorubicin auf unterschiedliche Weise. Die Funktionalisierung der Nanopartikel wird mit FCS, DLS, FT-IR-, UV/Vis- und Fluoreszenz-Spektroskopie, sowie Zetapotential-Messungen charakterisiert. Durch Bestimmung der Doxorubicin-Konzentration, mittels UV/Vis zeigt sich, dass die Anbindung von Doxorubicin nur an die entsprechende äußerste Schicht erfolgte. Die Doxorubicin-Konzentration änderte sich mit steigender Schichtanzahl nicht. Versuche zur Verkapselung von Doxorubicin, sowie biologische Vortests zur Charakterisierung der funktionalisierten Nanopartikel werden derzeit durchgeführt. Ebenfalls wird für die Oberflächenbeschichtung der MnZn-MNP ausgewählte Bisphosphonate (Alendronsäure oder 1,1-Diphosphono-2,3-Dicarbonsäure) sowie synthetische Aminosäuren (6-Aminohexansäure) verwendet. Auf Grund der hohen Affinität von Bisphosphonaten zu Knochen, stellen diese beschichteten Nanopartikel ein mögliches Einsatzgebiet zur Behandlung von Knochenkrebs dar. Da der eingesetzte Wirkstoff keine Autofluoreszenz aufweist, müssen diese beschichteten Nanopartikel mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. FITC oder DAPI) markiert werden, um so den Einsatz von bildgebenden Analyseverfahren möglich zu machen. Durch die thermische Beständigkeit der Beschichtungsmaterialien erfolgte die Synthese der MnZn-Ferrite in deren Gegenwart. Es kann bei allen eingesetzten Materialien die erfolgreiche Beschichtung sowie die Anbindung von FITC bzw. DAPI nachgewiesen werden.Die synthetisierten, multifunktionalen MnZn-MNP zeigen insgesamt ein hohes Potential für eine spätere medizinische Anwendung. Hierbei verbinden diese funktionalisierten Partikel die physiko-chemischen Eigenschaften der Nanopartikel mit der therapeutischen Aktivität des Wirkstoffs.
The focus of this thesis is the synthesis of multifunctional magnetic nanoparticles for biomedical applications. Biocompatible ferrites with the chemical composition Mn0.8Zn0.2Fe2O4 are synthesized by the co-precipitation of the corresponding metal chlorides in sodium hydroxide solution. For application in biological organisms, the nanoparticles surface has been coated with different techniques with selected biocompatible polymers and functionalized with Doxorubicin, a chemotherapeutic drug. Following this the potential of Doxorubicin functionalized nanoparticles are in-vitro tested to be used in adoptive cancer immunotherapy, a new approach where immune cells, especially T lymphocytes, will be exploited as autonomous drug delivery systems with high target specifity. The activation of dextran is done by functionalisation via aldehyde, carboxymethyl or amino groups and subsequently the attachment of doxorubicin. The successful attachment of Doxorubicin to the dextran derivates coated nanoparticles is characterised by using dynamic light scattering (DLS), Raman-, FT-IR-, UV/Vis- and fluorescence spectroscopy. The uptake efficiency of the modified magnetic nanoparticles into T lymphocytes is verified by fluorescence and confocal microscopy. The functionality of the drug attached to the particles and internalized into cells is further characterised. Thus, among others, the cytotoxic effect evoked on T lymphocytes is determined and drug release kinetics are monitored. The layer-by-layer technique is the second method which is used for coating the nanoparticles surface. The LbL process offers the opportunity not only to vary the layer thickness but also by changing the selected polyelectrolytes like PAH (poly(allylamine hydrochloride)), PAA (polyacrylic acid), PEI (polyethyleneimine) or PSSa-co-MA (Poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid)) to encapsulate drugs or biomolecules in the different layers of the system. This protected drug delivery effectively increases the survival rate of the T cells and connected to this the time slot in which drug loaded T cells have to reach the target (cancer cells or tumors). Common techniques like transmission electron microscopy (TEM), FT-IR, Zetapotential and DLS are used to proof the success of the coating and the colloidal stability of the coated nanoparticles. It turns out the multilayer system consisting of PAH and PAA as well as of PEI and PSSa-co-MA show the highest potential for a subsequent functionalisation with Doxorubicin. Due to the polyelectrolyte building the last layer of the multilayer system the bonding of Doxorubicin takes place in different ways. The successful bonding of the drug to the LbL coated nanoparticles is verified by using Zetapotential, DLS, TEM, FT-IR, UV/Vis- and fluorescence-spectroscopy. Determining the concentration of Doxorubicin with UV/Vis-spectroscopy shows the bonding of the drug occurs only to (with?) the corresponding outer layer. The drug concentration does not change by increasing the number of layers. Tests for encapsulation of the drug as well as biology pre-test for the characterisation of the functional nanoparticles are presently running. The surface modification of the nanoparticles is also done by using selected bisphosphonates (alendronic acid or 1,1-diphosphono-2,3-dicarboxylic acid) and synthetic amino acid like 6-aminocaproic acid. Due to the high affinity of bisphosphonate coated particles to bones a possible application of these particles could be the treatment of bone cancer. In this case the used drug shows no specific fluorescence, therefore it is necessary to mark the coated particles additionally with a fluorescence dye like FITC or DAPI. Because of the thermal resistance of the used materials it is possible to synthesis the nanoparticles in the presence of the coating substance. In all cases the successful coating of the particles as well as the bonding of FITC or DAPI to the coated nanoparticles is verified. Due to this the drug loaded particles show a high potential for future drug delivery applications. The modified magnetic nanoparticles combine the physico-chemical properties of the nanoparticles with the therapeutic effectivity of the drug.
2012-01-12
2017-07-12T07:27:34Z
2012-01-12
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45465
hdl:20.500.11880/22820
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22764
ger
openAccess
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228212019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Iron dependent post-translational regulation of the bHLH transcription factor FIT in Arabidopsis thaliana
Eisenabhängige post-translationale Regulation des bHLH Transkriptionsfaktors FIT in Arabidopsis thaliana
Meiser, Johannes
Bauer, Petra
ddc:500
Ackerschmalwand
Transkriptionsfaktor
Pflanzenhormon
Eisen
Arabidopsis thaliana
Proteinregulation
Modifikation
bHLH
FIT
iron
Arabidopsis
transcription factor
nitric oxide
post-translational modification
Iron (Fe) is an essential micronutrient for most organisms, but too high Fe contents can cause the formation of free radicals. Hence, Fe uptake must be tightly regulated. Root iron acquisition in non-graminaceous plants, like the model plant Arabidopsis thaliana, is achieved by reduction of soil Fe by the reductase FRO2 and its subsequent uptake by the metal transporter IRT1. The bHLH transcription factor FIT is required for high-level expression of FRO2 and IRT1 upon Fe deficiency. In this work we investigated post-transcriptional regulation of FIT. We found Fe dependent post-transcriptional regulation of FIT in way of constant turnover. Small amounts of active FIT were found to be sufficient to trigger the expression of FRO2 and IRT1. FIT protein stability relies on the presence of the signalling compound nitric oxide (NO). NO mediated stabilisation of FIT is independent of transcriptional regulation and is most probably achieved by counteracting proteasome dependent degradation of FIT. We summarise our results in an integrative model and based on this we made further efforts to identify post-translational modifications that could regulate FIT activity. Based on in silico prediction we identified four amino acids in the c-terminal part of FIT as putative phosphorylation sites. With newly generated FIT forms containing phosphomicking or non-phosphorylatable mutations we can draw further conclusions and suggest that phosphorylation may regulate FIT activity.
Eisen (Fe) ist ein essentieller Mikronährstoff für Lebewesen. Jedoch können zu hohe Konzentrationen an Eisen die Bildung freier Radikale zur Folge haben. Die Eisenaufnahme aus dem Boden erfolgt bei der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, sowie bei allen Nicht-Gräsern, mittels Reduzierung des im Boden enthaltenen Eisens, durch die Reduktase FRO2 und durch die Aufnahme des Metalltransporters IRT1. Bei Eisenmangel wird der bHLH Transkriptionsfaktor FIT für die verstärkte Transkription von FRO2 und IRT1 benötigt. In dieser Arbeit wurde die post-transkriptionelle Regulation von FIT untersucht und es konnte eine eisenabhängige Regulation von FIT nachgewiesen werden. Geringe Mengen an FIT waren ausreichend um die Expression der Zielgene zu induzieren. Die Stabilität von FIT ist abhängig von dem Signalmolekül Stickstoffmonoxid (NO). Die transkriptionsunabhängige Stabilisierung von FIT durch NO erfolgt wahrscheinlich durch eine Hemmung der Proteasom-abhängigen Degradation von FIT. Wir haben unsere Ergebnisse in einem Modell zusammengefasst und weisen darauf basierend post-translationale Mechanismen auf, welche die Aktivität von FIT regulieren könnten. Vier Aminosäuren innerhalb des c-terminalen Teils von FIT wurden anhand von in silico Analysen als mögliche Phosphorylierungsstellen identifiziert. Neu hergestellte FIT Formen, welche eine Phosphorylierung oder eine Dephosphorylierung imitieren, zeigten, dass Phosphorylierung ein potentieller Faktor ist, um die FIT-Aktivität zu regulieren.
2012-01-13
2017-07-12T07:27:35Z
2012-01-13
2011
2016-04-04
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45522
hdl:20.500.11880/22821
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22765
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228242019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Evaluation of finite dose skin absorption experiments with respect to experimental setup and mathematical modelling
Evaluierung von Hautabsorptionsversuchen mit finiter Dosierung im Hinblick auf experimentellen Aufbau und mathematische Modellierung
Hahn, Tsambika
Schäfer, Ulrich F.
ddc:500
Hautresorption
Mathematisches Modell
Arzneimitteldosis
Hautabsorption
finite Dosierung
skin absorption
finite dose
mathematical modelling
In this thesis finite dose skin absorption experiments were evaluated with respect to experimental setup and mathematical modelling. To increase the comparability between experiment and modelling, the experiments need to be carefully assessed. Thus, the use of infrared densitometry was judged suitable to quantify SC on tape-strips in vitro to increase the accuracy of the obtained concentration depth profiles in the SC. In vivo, usually a small dose of the formulation is applied to the skin, a so-called finite dose. Finite dose skin absorption experiments were performed, which are closer to the in vivo reality. The influence of non-homogeneous donor surface distribution was investigated with respect to the permeated drug amount as this had not been done before. A dependence on the physicochemical parameters of the drug was found. With the knowledge obtained before, finite dose skin penetration experiments were performed. The experimental data was analyzed with different mathematical models. A pharmacokinetic model developed for this study could describe the mass profiles in all compartments well, even in the lateral skin part. A 2D diffusion model previously developed for infinite dose and adapted to finite dose could predict the mass profiles and concentration depth profiles of finite dose experiments for the model drugs caffeine and flufenamic acid reasonably.
In dieser Arbeit wurden finite dose Hautabsorptionsversuche evaluiert im Hinblick auf experimentellen Aufbau und mathematische Modellierung. Um die Vergleichbarkeit zwischen Experiment und Mathematik zu verbessern, müssen die Versuche sorgfältig überprüft werden. Deshalb wurde Infrarot Densitometrie untersucht und als geeignet befunden, SC auf Tape-strips in vitro zu quantifizieren, um die Präzision von Konzentrationsschichttiefenprofilen im SC zu erhöhen. In vivo wird üblicherweise eine kleine Donormenge auf die Haut aufgetragen, eine sogenannte finite dose. Finite dose Hautabsorptionsversuche wurden durchgeführt, ähnlich der in vivo Situation. Der Einfluss von inhomogener Donorverteilung auf der Hautoberfläche wurde in Abhängigkeit der permeierten Arzneistoffmenge analysiert, was bisher noch nicht getan wurde. Es wurde eine Abhängigkeit von den physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffes gefunden. Mit dem zuvor erhaltenen Wissen wurden Hautpenetrationsversuche mit finiter Dosierung durchgeführt. Die experimentellen Daten wurden mit verschiedenen mathematischen Modellen analysiert. Ein für diese Studie entwickeltes pharmakokinetisches Modell konnte die Massenprofile in allen Kompartimenten gut beschreiben, sogar im lateralen Hautteil. Ein zuvor für infinite dose entwickeltes und nun für finite dose adaptiertes 2D Diffusionsmodell konnte die Massenprofile und Konzentrationsschichttiefenprofile für die Modellarzneistoffe Coffein und Flufenaminsäure plausibel vorhersagen.
2012-01-20
2017-07-12T07:27:36Z
2012-01-20
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45755
hdl:20.500.11880/22824
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22768
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228272019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
In vitro characterization of the novel solubility enhancing excipient Soluplus®
In vitro Charakterisierung des neuartigen Lösungsvermittlers Soluplus®
Linn, Michael
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Micelle
Löslichkeit
Formulierung <Technische Chemie>
Pharmazeutischer Hilfsstoff
Pharmazeutische Technologie
micelle
solubility
formulation
excipient
pharmaceutical technology
Although the oral route is preferred for drug administration due to its convenience for the patient, many new chemical entities suffer from low oral bioavailability due to poor aqueous solubility. Especially for BCS class II drugs, overcoming the limited solubility is crucial for a successful therapy. A relatively new technique in this context is the use of hot melt extrusion for the production of fast dissolving solid solutions. This thesis focuses on the novel excipient Soluplus®, combining solubilization and the ability to form solid solutions by hot melt extrusion in one molecule. The potency of different formulations to improve the bioavailability of BCS class II drugs was evaluated in the Caco-2 cell culture model. An excellent correlation between in vitro transport across cells and in vivo studies in dogs was found. As many solubilizers can modulate active transporters, Soluplus® was tested in Caco-2 cells for a possible interaction with the P-glycoprotein efflux system. An efflux inhibition by Soluplus® at comparably high effective concentrations was found. Uptake studies in MDCK II cells validated these results. Furthermore, the mechanism of interaction between Soluplus® and model drugs was studied, allowing the optimization of formulations with regards to drug/excipient ratios. There is a window of ratios with maximal transport rates across Caco-2 cells, as result of an interplay between solubilization, binding of drug to Soluplus® and the amorphous state of the drugs.
Die beliebtesten Arzneiformen sind die zur oralen Gabe. Viele neue Arzneistoffe besitzen allerdings eine geringe orale Bioverfügbarkeit auf Grund ihrer schlechten Wasserlöslichkeit. Insbesondere für BCS Klasse II Substanzen ist die geringe Löslichkeit die entscheidende Hürde für eine erfolgreiche Therapie. Eine neue Technik zur Überwindung dieser Hürde ist die Schmelzextrusion zur Herstellung schnellauflösender fester Lösungen. In dieser Arbeit wurde der neuartige Hilfsstoff Soluplus® untersucht, welcher Löslichkeitsverbesserung und die Möglichkeit zur Herstellung fester Lösungen durch Schmelzextrusion in einem Molekül vereinigt. Die Wirksamkeit von Formulierungen mit Soluplus® wurde im Caco-2 Zellkulturmodell beurteilt. Eine sehr gute Korrelation ergab sich zwischen dem Arzneistofftransport über Caco-2-Zellen und in vivo Studien an Beaglen. Da viele Solubilizer den Effluxtransporter P-Glykoprotein modulieren, wurde Soluplus® auf eine solche Interaktion getestet. An Caco-2 und MDCK-II Zellen konnte eine P-gp-Hemmung bei hoher Soluplus® -Konzentration gezeigt werden. Zusätzlich wurde die Interaktion zwischen Soluplus® und Modellarzneistoffen untersucht. Hierbei wurden Formulierungen hinsichtlich des Verhältnisses zwischen Arzneistoff und Hilfsstoff optimiert. Ein Optimum für maximalen Arzneistofftransport konnte an Caco-2- Zellen gezeigt werden, welches sich aus dem Zusammenspiel von Solubilisierung, Bindung des Arzneistoffs zu Soluplus® und der Amorphizität des Arzneistoffs ergibt.
2012-01-27
2017-07-12T07:27:37Z
2012-01-27
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-45516
hdl:20.500.11880/22827
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22771
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228372019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Development of the first metabolite-based LC-MSⁿ urine drug screening procedure
Entwicklung des ersten Metaboliten-basierten LC-MSⁿ Medikamenten Screening Verfahrens für Urin
Wissenbach, Dirk K.
Maurer, Hans H.
ddc:500
Tandem-Massenspektrometrie
LC-MS
Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie
Screening
Harn
Metabolit
Urin
LC-MSn
Urine
LC-MSn
Metabolite
Screening
In the presented dissertation, the development of the first metabolite-based LC-MS screening approach is described. It consisted of establishing a simple and fast sample workup, fast and sufficient LC separation, MS settings for recording reproducible spectra, and a suitable screening concept. Using these methods, MS2 and MS3 spectra of parent drugs were recorded as well as those of their metabolites after having identified them in urine samples of rats and humans. By using the described methods, the new reference library (over 1,000 parent drugs, 2,700 metabolites, 100 biomolecules), and a sophisticated software tool, a new routine screening approach was established. This LC-MS screening approach is nowerdays an important part of the systematic toxicological analysis and showed excellent robustness and screening results in thousands of authentic patient samples. According to this, this LC-MS approach complements the established GC-MS approach. In addition, recent research projects are partly based on the developed workup, separation and/or detection methods. Finally, this procedure and the reference library could successfully be transferred to another apparatus type, which raised the hope of an instrument independent LC-MS reference library.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Entwicklung eines Metaboliten-basierten LC-MS Screenings beschrieben. Dazu wurden eine einfache und schnelle Probenvorbereitung, eine schnelle und effektive LC-Trennung, MS Settings zur Aufnahme reproduzierbarer Spektren und schließlich ein geeigneten Screening-Konzept entwickelt. Damit wurden MS2 and MS3 Spektren von Muttersubstanzen und ihren Metaboliten aufgenommen, die zuvor in Ratten- oder Patientenurinen identifiziert worden waren. Mit Hilfe dieser Methoden, der neuen Referenzbibliothek (über 1000 Muttersubstanzen, 2700 Metaboliten, 100 Biomoleküle) und einer speziellen Auswertesoftware konnte ein neues Routine-Screeningverfahren etabliert werden. Das entwickelte LC-MS System ist heutzutage ein wichtiger Bestandteil der systematischen toxikologischen Analyse. Bei mehreren tausend Patientenproben zeigte es sehr hohe Robustheit und sehr gute Screening-Ergebnisse. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass dieses LC-MS-Verfahren das etablierte GC-MS-Verfahren ideal ergänzt. Zusätzlich stellten die entwickelten Aufarbeitungs-, Trennungs- und/oder Detektionsmethoden eine wichtige Grundlage für andere aktuelle Forschungsprojekte des Arbeistkreises dar. Schließlich konnte gezeigt werden, dass dieses Verfahren und die zugrunde liegende Referenzbibliothek auf einen anderen Gerätetyp erfolgreich übertragen werden kann. Dies lässt Hoffnung auf eine langersehnte geräteunabhänige LC-MS Referenzbibliothek zu.
2012-03-30
2017-07-12T07:27:40Z
2012-03-30
2012
2012-03-30
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-47979
hdl:20.500.11880/22837
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22781
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228472019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Organotypic functional cultures of human liver cells for long-term maintenance and assessment of drug-induced metabolome effects
Organotypische funktionelle Leberzellkulturen zur Langzeitkultivierung und Detektion von Arzneistoff-induzierten metabolischen Effekten
Müller, Daniel
Heinzle, Elmar
ddc:500
Metabolom
Leberepithelzelle
Organkultur
In-vitro-Kultur
3D Kultivierung
Organotypische Kultivierung
liver
hepatocytes
metabolome
3D cultivation
The goals of this thesis were (i) to establish and improve organotypic liver cell culture techniques for long-term pharmacological studies and (ii) to develop and apply a metabolomics based approach for the assessment of drug-induced effects. As first model, a 3D bioreactor system was characterized in terms of cell physiology and functionality. Primary human hepatocytes could be kept viable and functional for more than 2 weeks in this system. Optimization of the system allowed determination of oxygen uptake rates and viability. As second 3D system, a hanging drop method was successfully applied for the generation of organotypic cultures as high-throughput in vitro model for toxicity studies.
For the investigation of drug-induced metabolic effects, a metabolomics approach based on GCTOF-MS combined with multivariate statistics was developed. In 2D cultures of primary human hepatocytes, both short-term (up to 4 days) and long-term (3 weeks) drug-induced effects were detected at clinically relevant concentrations, showing the sensitivity of the established method.
Both 3D cultivation methods used in this thesis represent a step forward to organotypic cultures as in vitro alternatives to animals and are particularly suitable for the investigation of chronic toxicity. The established metabolomics approach is a sensitive tool to assess drug-induced changes even at subtoxic concentrations and can be applied to other cell types and cultivation systems in the future.
Die Ziele dieser Arbeit waren (i) die Etablierung und Verbesserung von organotypischen Leberzellkulturtechniken für pharmakologische Studien und (ii) die Entwicklung und Anwendung einer Metabolomics-Methode zur Detektion von Wirkstoff-induzierten Effekten. Als erstes Modell wurde ein 3D Bioreaktor in Hinblick auf Zellphysiologie und -funktionalität untersucht. Primäre Hepatozyten konnten über mehr als 2 Wochen vital und funktionell in diesem System kultiviert werden. Eine Systemoptimierung erlaubte die Bestimmung von Sauerstoffaufnahmeraten und Viabilität. Als zweites 3D System wurde die Methode des hängenden Tropfens erfolgreich zur Herstellung von organotypischen Kulturen für Toxizitätsstudien eingesetzt.
Zur Untersuchung von Wirkstoff-induzierten metabolischen Effekten wurde in dieser Arbeit eine Metabolomics-Methode entwickelt, basierend auf einer Kombination von GCTOF-MS und multivariater Statistik. In 2D Kulturen von primären Hepatozyten wurden sowohl Kurzzeit- (bis zu 4 Tagen) als auch Langzeit- (3 Wochen) Effekte bei klinisch relevanten Konzentrationen nachgewiesen, was die Sensitivität der Methode zeigt.
Beide 3D Systeme, die in dieser Arbeit eingesetzt wurden, sind als organotypische in vitro Alternativen zu Tierversuchen zur Untersuchung von chronischer Toxizität geeignet. Die etablierte Metabolomics-Methode ist eine sensitive Technik um Wirkstoff-induzierte, subtoxische Effekte zu detektieren und kann in Zukunft auf andere Zelltypen und -systeme angewendet werden.
2012-04-26
2017-07-12T07:27:43Z
2012-04-26
2011
2012-04-26
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-48360
hdl:20.500.11880/22847
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22791
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228562019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Evaluierung von Inhibitoren der 17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenasen mittels enzymkinetischer und zellulärer Methoden
Evaluation of inhibitors of 17beta-hydroxysteroid dehydrogenases using enzyme kinetics and cellular methods
Werth-Brill, Ruth
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Brustkrebs
Endometriose
Osteoporose
Hydroxysteroid-Dehydrogenasen
Inhibitor
Estradiol
Hemmmechanismus
T47D
17beta-HSD
nichtsteroidale Hemmstoffe
breast cancer
endometriosis
osteoporosis
estrogen dependent disease
nonsteroidal inhibitor
17β-Hydroxysteroid Dehydrogenasen sind wichtige Regulatoren der intrazellulären Aktivität von Steroidhormonen. Ihre Hemmung ist ein interessanter Ansatzpunkt zur Behandlung von Erkrankungen, die ihre Ursache in einem Überschuss oder Mangel an intrazellulär verfügbaren aktiven Hormonen haben. Im Rahmen der Entwicklung von 17β-HSD1-Hemmstoffen zur Behandlung von Brustkrebs und Endometriose wurde ein zellulärer Assay entwickelt und die intrazelluläre Wirksamkeit der Inhibitoren untersucht. Mit Hilfe des etablierten Assays in T47D-Zellen konnten strukturell verschiedene 17β-HSD1-Inhibitoren untersucht und intrazellulär aktive Hemmstoffe mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich identifiziert werden. 17β-HSD2-Inhibitoren werden als potentielle Wirkstoffe zur Behandlung von Osteoporose untersucht. Für ausgewählte Inhibitoren aus verschiedenen Substanzklassen wurde der Hemmmechanismus mittels enzymkinetischer Studien aufgeklärt. Dabei wurden sowohl ein kompetitiver Inhibitor als auch „mixed-type“ und nichtkompetitive Inhibitoren identifiziert. Die Kenntnis der unterschiedlichen Hemmmechanismen bildet in Kombination mit in silico Methoden die Grundlage für das weitere Inhibitordesign. 17β-HSD2-Hemmstoffe werden in einem Screeningsystem auf ihre Wirksamkeit und Selektivität überprüft. Zum Nachweis der Wirksamkeit der 17β-HSD2-Hemmstoffe in Targetzellen wurde ein zellbasierter Assay in Osteoblasten entwickelt, mit dem eine Verbindung mit einem IC50-Wert unter 1µM identifiziert werden konnte.
17β-Hydroxysteroid dehydrogenases are important regulators of the intracellular activity of steroid hormones. Hence, inhibition of 17β-HSDs is an interesting approach for the treatment of diseases caused by excess or deficiency of intracellulary active hormones. Since 17β-HSD1 inhibitors are a therapeutic option for breast cancer and endometriosis, a cell-based assay was established in T47D breast cancer cells to investigate the inhibitor‘s intracellular efficacy. Non steroidal 17β-HSD1 inhibitors of three structurally different classes were tested and in each of them compounds with IC50 values in the nanomolar range were identified. Inhibition of 17β-HSD2 is a new therapeutic approach for the treatment of osteoporosis. The inhibition mechanism of selected structurally different inhibitors was elucidated by enzyme kinetics. Competitive as well as mixed type and non competitive inhibition mechanisms were found. Knowledge of the different inhibition mechanism in combination with in silico methods will improve the further inhibitor design. Activity and selectivity of 17β-HSD2 inhibitors are evaluated in a comprehensive screening system. A cell based assay for 17β-HSD2 inhibitors was established in osteoblastic target cells and an inhibitor with an IC50 value below 1 µM was identified.
2012-06-22
2017-07-12T07:27:47Z
2012-06-22
2012
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-48751
hdl:20.500.11880/22856
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22800
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228602019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Bio-nano interactions in the peripheral lungs: role of pulmonary surfactant components in alveolar macrophage clearance of nanoparticles
Bio-nano Interaktionen in der peripheren Lunge: die Rolle der Komponenten des Pulmonalen Surfactants in der Nanopartikel-Clearance durch Alveolarmakrophagen
Ruge, Christian Arnold
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Surfactant-Proteine
Surfactant-Protein A
Nanopartikel
Alveolarphagozyt
Clearance
Pharmazeutische Technologie
SP-A
SP-D
nanoparticle
pulmonary surfactant
SP-A
SP-D
alveolar macrophage
Bio-nano interactions can be considered as the sum of complex processes and reactions occurring when nanoparticles (NP) get in contact with living systems. Regarding deposition of NPs in the lungs, interactions with the here primarily encountered biological matter, i.e. pulmonary surfactant (PS) are of particular interest, as they might play a significant role the further biological fate of such systems. Therefore, the central topic of this work was to investigate the binding of relevant components from PS to model NPs with chemically differing surface modifications. Moreover, effects of PS biomolecules on NP uptake by alveolar macrophages (AM) as the main clearance pathway for particulate matter from the peripheral lungs were studied. It could be demonstrated that adsorption of surfactant proteins A (SP-A) and D (SP-D) to NPs occurs in a manner primarily dependent on particle material properties. In addition, the further interaction of such protein-particles complexes with AMs is greatly influenced by these proteins. Furthermore, it could be shown that surfactant lipids can modulate such protein-mediated effects, leading to the overall conclusion that the complex interplay of PS components potentially assimilates the AM clearance of NPs, regardless of their surface properties. In summary, these findings contribute to a better understanding of how NP-based systems interact at the air- blood-barrier.
Wenn Nanopartikel (NP) mit lebenden Systemen in Kontakt kommen, laufen komplexe Prozesse und Reaktionen ab, die in ihrer Gesamtheit als Bio-Nano- Wechselwirkungen (Ww) beschrieben werden. Hinsichtlich der Abscheidung von NP in der Lunge sind die Ww mit den dort vorzufindenden Strukturen von besonderem Interesse. Gerade die Bestandteile des pulmonalen Surfactants (PS) können hier eine Schlüsselrolle einnehmen und biologische Reaktionen in Folge ihrer Ww mit NP maßgeblich beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher das Bindungsverhalten von Bestandteilen des PS an Modell-NP in Abhängigkeit ihrer Oberflächeneigenschaften getestet. Zudem wurde der Einfluss von PS–Bestandteilen auf die zelluläre Aufnahme durch Alveolarmakrophagen (AM) untersucht, welche essentiell zur Elimination von Partikeln aus der Lunge beitragen. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Adsorption von Surfactant Protein A (SP-A) und D (SP- D) vor allem von NP-Materialeigenschaften abhängig ist, und dass die adsorbierten Proteine die AM-Aufnahme von NP erhöhen. Es wurde zudem gezeigt, dass Surfactant Lipide in der Lage sind, proteinvermittelte Effekte zu modulieren. Insbesondere konnte eine Angleichung der Aufnahmerate von unterschiedlichen NP durch AM beobachtet werden, welche dem komplexen Zusammenspiel der verschiedenen PS-Bestandteile zuzuschreiben ist. Insgesamt tragen die hier vorgestellten Ergebnisse zu einem besseren Verständnis des Verhaltens von NP an der Blut-Luft-Schranke bei.
2012-07-03
2017-07-12T07:27:48Z
2012-07-03
2012
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-48888
hdl:20.500.11880/22860
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22804
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228702019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Development of potent and selective inhibitors of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 : a new target for the treatment of osteoporosis
Wetzel, Marie
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Osteoporose
Inhibitor
Hydroxysteroid-Dehydrogenasen
Hemmstoff
17beta-HSD2
17beta-HSD2
osteoporosis
inhibitors
Using a ligand-based approach, we designed and synthesised novel non-steroidal 17beta-HSD2 inhibitors from two scaffolds described in literature as potential drugs for the treatment of osteoporosis. These compounds bear a hydrophobic core and two polar moieties, distant from each other circa 11Å, mimicking the two hydroxy group at the C3 and C17 position of the steroid E2. The best OH-OH substitution pattern was first elucidated in an optimisation process. Addition of further substituents to the best scaffold was investigated to enhance its activity and selectivity. Most of the synthesised compounds are potent 17β-HSD2 inhibitors with IC50 values in the low nanomolar range. Besides an outstanding selectivity towards 17β-HSD1 and a negligible affinity to the ERα and ERβ, the most promising compound of this thesis (II.19) displays high selectivity towards 17β-HSD4 and 17β-HSD5. It exhibits also good cell permeability in MDA-MB-231 cells, expressing naturally 17β-HSD2 and an excellent activity in rat, mouse and monkey enzymes. To conclude, the present work presents a broad SAR study of two classes of compounds regarding 17β-HSD2 inhibition and all of these results helped to generate a good homology model of the protein with the goal to better understand how potential drug binds in the enzymatic pocket.
Aus zwei in der Literatur beschriebenen Grundgerüsten und mit Hilfe eines Ligand-basierten Ansatzes, wurden neue nicht-steroidale 17β-HSD2 Hemmstoffe designet und synthetisiert, als potentielle Therapeutika für die Behandlung von Osteoporose. Diese Verbindungen besitzen ein hydrophobes Grundgerüst und zwei polare Reste in einem Abstand von 11Å, die die Positionen C3 und C17 von Estradiol nachahmen. Im ersten Optimierungsprozess wurde das optimale Substitutionsmuster für die zwei OH-Funktionen ermittelt. Zusätzlich wurde die Einführung von weiteren Substituenten in die beste Leitstruktur untersucht, um Aktivität und Selektivität zu erhöhen. Die meisten synthetisierten Verbindungen sind hochpotente 17β-HSD2 Inhibitoren mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Die beste Verbindung in dieser Doktorarbeit (II.19) besitzt eine sehr gute Selektivität gegenüber 17β-HSD1 sowie ein sehr geringe Affinität zum ERα und ERβ, und zeigt eine hohe Selektivität gegen 17β-HSD4 und 17β-HSD5. II.19 weist auch gute Zellgängigkeit in MDA-MB-231 Zellen auf und eine exzellente Aktivität am Ratten-, Mäuse- und Affen-Enzym. Die vorliegende Arbeit liefert einen breiten Einblick in die Struktur-Wirkungbeziehungen zweier neuer Klassen von 17β-HSD2-Hemmstoffen. Diese Ergebnisse haben dazu beigetragen, ein gutes Homologiemodell des Proteins zu entwickeln. Mit ihnen war es ferner möglich die Bindungstelle von potentiellen Therapeutika in der enzymatischen Bindetasche zu charakterisieren.
2012-07-27
2017-07-12T07:27:51Z
2012-07-27
2011
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-49096
hdl:20.500.11880/22870
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22814
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228772019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Characterization of protein-ligand interactions : the role of thermodynamic and structural data in the drug discovery process
Charakterisierung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen : die Rolle von thermodynamischen und strukturellen Daten in der Wirkstoffentwicklung
Klein, Tobias
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Pharmazeutische Chemie
Wirkstoff-Rezeptor-Bindung
Infektionskrankheit
Pseudomonas aeruginosa
Arzneimitteldesign
Transkriptionsregulator PqsR
Computergestütztes Wirkstoffdesign
Isotherme Titrationskalorimetrie
17beta-HSD 1
Quorum Sensing
transcriptional regulator PqsR
computer-aided drug design
isothermal titration calorimetry
17beta-HSD1
quorum sensing
Comparing biological activities and thermodynamic profiles obtained for one compound toward proteins, differing only in few residues is a promising strategy to increase the knowledge of protein-ligand interactions and active site topologies thereby enabling rational drug design.
For this purpose, wild type proteins and their mutants carrying a set of point mutations can be used. Such an approach was applied in the present study to guide the development of small-molecule antagonists targeting PqsR, a novel target to limit Pseudomonas aeruginosa pathogenicity. It resulted in two chemically divers fragments with antagonistic activity and provided insights into their binding modes. The latter can be used to assist fragment optimization and therefore the identified PqsR antagonists are promising scaffolds for further drug design efforts against this important pathogen.
Alternatively, proteins from various species, which are highly conserved in sequence and differ only in few residues, might be considered. This line of attack was also utilized employing human and marmoset monkey 17β-HSD1, a promising target for the treatment of estrogen-dependent diseases. By means of in silico methods a better understanding of 17β-HSD1 active site topologies and inhibitor binding modes was achieved that guided the elaboration of a lead compound.
The described strategy was successfully applied for hit identification and lead optimization reflecting its benefit in drug design.
Die möglichst genaue Kenntnis der räumlichen Gestalt der Ligand Bindungsstelle und der damit verbundenen Protein-Ligand-Wechselwirkungen ist eine Voraussetzung für rationales Wirkstoffdesign. Eine aussichtsreiche Strategie um diese Informationen zu erhalten, ist es biologische/biophysikalische Daten einer Verbindung gegenüber Proteinen zu vergleichen, die sich nur in wenigen Aminosäuren unterscheiden.
Einerseits können dazu Wildtyp und Mutanten genutzt werden, was in dieser Studie zur Entwicklung von PqsR Antagonisten geführt hat. PqsR ist ein neues Target zur Limitierung der Pseudomonas aeruginosa Pathogenität. Zwei chemisch verschiedene, antagonistische Fragmente wurden entdeckt und Aufschlüsse über deren Bindungsmodi erhalten, die zur weiteren Optimierung genutzt werden können. Somit stellen die entdeckten Liganden vielversprechende Grundgerüste zur weiteren Wirkstoffentwicklung gegen dieses relevante Pathogen dar.
Alternativ können hochkonservierte Proteine verschiedener Spezies in Betracht gezogen werden. Unter Verwendung von humaner und marmoset 17β-HSD1, einem erfolgversprechenden Target zur Behandlung estrogenabhängiger Erkrankungen, wurden durch in silico Methoden das aktive Zentrum der 17β-HSD1 sowie Bindungsmodi ausgewählter Hemmstoffe untersucht. Anhand der erstellten Modelle wurde eine Leitverbindung weiterentwickelt.
Diese Strategie wurde erfolgreich für das Wirkstoffdesign bei der Hit Identifizierung sowie der Lead Optimierung angewendet.
2012-09-19
2017-07-12T07:27:53Z
2012-09-19
2012
2012-09-19
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-49626
hdl:20.500.11880/22877
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22821
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228782019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Quantification of red blood cell adhesion using holographic optical tweezers and single cell force spectroscopy
Die Quantifizierung der Adhäsion roter Blutzellen mittels holographischer optischer Pinzetten und Einzelzellspektroskopie
Steffen, Patrick
Wagner, Christian
ddc:500
Adhäsion
Zelladhäsion
Thrombozytenadhäsion
Optische Pinzette
Erythrozyt
Spektroskopie
cell adhesion
optical tweezers
red blood cells
In dependence on the ambient conditions, red blood cells tend to form aggregates. In this work two different adhesion phenomena of red blood cells were investigated. In order to investigate these phenomena, holographic optical tweezers, microfluidics and single cell force spectroscopy were used. The first investigated adhesion process takes place when activated platelets release a messenger that triggers the red blood cells to aggregate. The second adhesion process involves macromolecules that exert an osmotic pressure onto the red blood cells. These macromolecules trigger the cells to form aggregates that look similar to a stack of coins. Both phenomena could be investigated statistically as well as quantitatively.
Rote Blutzellen neigen in Abhängigkeit der Umgebungsbedingungen dazu Aggregate zu bilden. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Adhäsions-Phänomene roter Blutzellen untersucht und quantifiziert. Hierbei kamen Instrumente wie die optische Pinzette, Mikrofluidiken und Einzelzell-Spektroskopie zum Einsatz. Das erste untersuchte Adhäsionsphänomen findet während der Blutgerinnung statt, wenn aktivierte Blutplättchen Botenstoffe aussenden, die die roten Blutzellen zur Aggregation stimulieren. Das zweite untersuchte Adhäsionsphänomen tritt im statischen Blut oder bei geringen Scherraten auf. In diesen Fällen neigen rote Blutzellen dazu lineare Aggregate zu bilden die dem Abbild von Geldrollen ähneln. Diese unspezifisch auftretende Adhäsion erfolgt infolge eines osmotischen Drucks umgebender Makro-Moleküle. Beide Adhäsions-Phänomene konnten sowohl statistisch untersucht, als auch mittels der Einzelzell-Spektroskopie quantifiziert werden.
2012-09-26
2017-07-12T07:27:54Z
2012-09-26
2012
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-49612
hdl:20.500.11880/22878
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22822
eng
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228792019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Untersuchung des katalytischen Einflusses von Ceroxid auf die Direktverstromung von Kohlenstoff in einem SOFC-System
Study of the catalytic effect of ceria on the direct carbon conversion in an SOFC system
Desclaux, Pauline
Hempelmann, Rolf
ddc:500
Brennstoffzelle
Oxidkeramik
Elektrochemische Oxidation
Fester Brennstoff
Kohlenstoff
Festoxidbrennstoffzelle
Katalysator
Cerdioxid
SOFC
catalyst
ceria
carbon fuel
electrochemical oxidation
Direktkohlenstoff-Brennstoffzellen (DCFC) bieten hohe thermodynamische Wirkungsgrade, die aufgrund der positiven Reaktionsentropieänderung bei der elektrochemischen Oxidation von Kohlenstoff 100% geringfügig übersteigt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein DCFC-Teststand weiterentwickelt, der auf dem Konzept einer Festoxidbrennstoffzelle basiert. Dafür befindet sich ein Pressling aus Kohlenstoffpulver anodenseitig in direktem Kontakt mit einer kreisförmigen Elektrolytschicht (Flachzelle mit Standardkathode aus LSM).
Im Zentrum dieser Forschungsarbeit steht die Untersuchung von Elektrokatalysatoren, die unter dieser Konfiguration die Kinetik der Direktoxidation von Kohlenstoff erhöhen. Nach eingehender Literaturrecherche wurde hierfür Ceroxid ausgewählt. Dafür wurde ein Modell entwickelt, in dem die Einzelschritte der elektrochemischen Oxidation von Kohlenstoff angegeben werden, um die spezifische Wirkung von Ceroxid mit den Sauerstoffionen darzustellen.
Außerdem wurden modifizierte Anodenbeschichtungen hergestellt, die aus CuO, YSZ und unterschiedlichen Anteilen von GDC bestehen. Diese letzte Anodenkomponente wurde als Katalysator dank seines Ceroxidgehalts (CeO2) genutzt. Systematische Messungen von Vollzellen wurden im Temperaturbereich von 750 bis 850 °C durchgeführt, um den katalytischen Einfluss von Ceroxid auf die Kinetik sowie die Reaktionsselektivität der Direktoxidation von Kohlenstoff zu untersuchen.
Direct carbon fuel cells (DCFC) offer high thermodynamic efficiencies, slightly exceeding 100% in a wide temperature range due to the positive near-zero value of the reaction entropy change. During this PhD thesis, a DCFC setup has been developed, which is based on the concept of a solid oxide fuel cell. To do that, a pellet of carbon powder is directly placed in contact with the circular thin electrolyte layer at the anode side. Button cells with standard cathodes (LSM-based) have been used.
The focus of the research work has been turned towards the search of electrocatalysts, which enhance kinetics of the direct carbon conversion under this configuration. After an extensive literature research ceria has been selected. Thus, a model has been developed and proposed to explicitly explain the specific effect of ceria in interaction with the oxygen ions in the system. The single steps of the electrochemical oxidation of carbon are given.
Moreover, modified anode layers based on CuO, YSZ and GDC have been developed and deposited on the YSZ electrolytes. Anodes with different GDC contents have been prepared. This anode compound is also catalytic active because of its content in ceria (CeO2). Systematic measurements of whole cells have been performed in a temperature range of 750 to 850 °C in order to study the catalytic effect of ceria on the kinetics as well as reaction selectivity of direct conversion of carbon.
2012-10-16
2017-07-12T07:27:54Z
2012-10-16
2012
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-49759
hdl:20.500.11880/22879
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22823
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228802019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Kommunikationssysteme als Targets zur Überwindung von Resistenzen tumoraler und bakterieller Erkrankungen : 17beta-HSD1-Hemmstoffe und Quorum Sensing Inhibitoren
Communication systems as targets to overcome the resistance of tumoral and bacterial diseases : 17beta-HSD1- and Quorum Sensing Inhibitors
Henn, Claudia
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Oberflächenplasmonresonanz
Pseudomonas aeruginosa
Steroide
Östrogene
Infektion
Medizinische Chemie
surface plasmon resonance
Pseudomonas aeruginosa
steroids
estrogens
infections
Die Kommunikationssysteme von Eukaryoten und Prokaryoten bieten zahlreiche Ansatzpunkte zur Entwicklung innovativer Strategien zur Überwindung von Resistenzen bei der Behandlung von Krebs- und Infektionserkrankungen. Für 17β-HSD1-Inhibitoren als vielversprechender Ansatz zur Therapie von estrogen-abhängigen Erkrankungen wurde das Endometriosemodell in C. jacchus zur Durchführung eines in vivo Proof of Concepts identifiziert. Eine Reihe hochpotenter 17β-HSD1-Hemmstoffe wurde in vitro an Enzymen dieser Spezies untersucht und die Klasse der (Hydroxyphenyl)naphthole mit sehr gutem pharmakokinetischen Profil hinsichtlich ihrer speziesspezifischen Aktivität weiter optimiert. Die entwickelten 17β-HSD1-Inhibitoren zeigen eine hohe Aktivität an der humanen 17β-HSD1 und ein hochpotenter und selektiver Kandidat an C. jacchus 17β-HSD1 konnte identifiziert werden. Nach pharmakologischen Untersuchungen soll dieser Hemmstoff als Kandidat für Untersuchungen im Endometriosemodell dienen. Der Eingriff in das pqs-QS- System von P. aeruginosa über PqsD und PqsR bietet einen aussichtsreichen Angriffspunkt zur Überwindung von Antibiotikaresistenzen. In dieser Arbeit wurden SPR-Biosensorassays zur Untersuchung dieser beiden Targetproteine entwickelt. Der kinetische Mechanismus von PqsD wurde durch SPR-spektroskopisch-gestützte Ergebnisse geklärt. Die Kombination aus rationalem Design und biophysikalischen Methoden resultierte in den ersten „drug-like“ PqsR-Antagonisten. Die Hitverbindung dieser Studie zeigt darüber hinaus gute Aktivität in P. aeruginosa und hat sehr gutes Potential für eine weitere Optimierung.
The communication systems of eukaryotes and prokaryotes display targets for innovative therapeutic interventions to overcome resistance in the treatment of cancer and infectious diseases. As 17β-HSD1 inhibitors are promising compounds for the treatment of estrogen-dependent diseases, the endometriosis model in C. jacchus has been identified to adduce the in vivo proof of concept. A series of potent 17β-HSD1 inhibitors has been evaluated in vitro in this species and the class of the (hydroxyphenyl)naphthols with good pharmacokinetic properties has been optimized concerning their species-specific activity. The resulting 17β-HSD1 inhibitors are highly potent toward human 17β-HSD1 and at least one highly active and selective candidate toward 17β-HSD1 of C. jacchus was identified. After further pharmacological evaluation this compound might be able to be a candidate for the in vivo evaluation in C. jacchus. To interfere via PqsD and PqsR with the pqs QS-System of P. aeruginosa is a promising strategy to overwhelm antibiotic resistance. In the current work two SPR-biosensor assays have been developed to investigate these target proteins. The kinetic mechanism of PqsD was elucidated by SPR-based results. Moreover, by combination of rational design and biophysical methods the first drug-like PqsR-antagonists have been identified. The best compound showed good activity in P. aeruginosa and is a candidate for further optimization.
2012-10-18
2017-07-12T07:27:54Z
2012-10-18
2012
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-49650
hdl:20.500.11880/22880
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22824
ger
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228862019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Von Polysulfanen, hochreaktiven S8-Nanopartikeln und organochalkogenhaltigen Redoxkatalysatoren: Identifizierung und Charakterisierung neuer, potentieller Wirkmechanismen und intrazellulärer Targets
From polysulfanes, highly reactive S8 nanoparticles and organochalcogen based redox catalysts: identification and characterization of new potential modes of action and intracellular targets
Schneider, Thomas
Jacob, Claus
ddc:500
Schwefel
Selen
Tellur
Reaktive Sauerstoffspezies
Sulfanderivate
Nanopartikel
Wirkungsmechanismus
intrazelluläre Targets
sulfur
selenium
tellurium
reactive oxygen species
polysulfanes
nanoparticles
intracellular targets
Die vorliegende Dissertation beschreibt die Charakterisierung und Identifizierung neuer, biologischer Wirkmechanismen von schwefelhaltigen Naturprodukten (Polysulfanen), elementaren, synthetischen Nanopartikeln und hochselektiven, organochalkogenhaltigen Redoxkatalysatoren. Dabei konnte für die natürlich vorkommenden Polysulfane zum ersten Mal in humanen roten Blutzellen gezeigt werden, dass ein bislang unbekannter membranzentrierter Mechanismus und neuartige Wechselwirkungen mit Metalloproteinen für (viele der) beobachteten Aktivitäten verantwortlich sind. Hingegen wirken die organochalkogenhaltigen, chinoiden Redoxkatalysatoren selektiv auf das Zytoskelett (Tubulin/Aktin), was ihre Fähigkeit erklärt, das Wachstum von Krebszellen (selektiv) zu hemmen. In einer High-Content Analyse in verschiedenen biologischen Modellen (u.a. Krebszellen und Saccharomyces cerevisiae) wurden zum ersten Mal definierte, intrazelluläre Targets von zwei hochreaktiven tellurhaltigen Redoxkatalysatoren (2-(Phenyltellanyl)-3-methylnaphthoquinon und 2,3-Bis(phenyltellanyl)naphthoquinon) mittels moderner Methoden (u.a. markierungsfreies Monitoring von Zellen über Impedanz-Messungen) identifiziert. Die chalkogenhaltigen Nanopartikel weisen ebenfalls eine interessante biologische Aktivität (gegen Steinernema feltiae und Plasmodium falciparum) auf, die wahrscheinlich auf das besondere Redox-Verhalten dieser Nanostrukturen zurückzuführen ist und in Zukunft ebenfalls weiter erforscht werden muss.
This PhD thesis describes the characterization and identification of new biological modes of action of sulfur containing natural products (polysulfanes), elemental synthetic nanoparticles and highly selective organochalcogen based redox catalysts. It could be shown for naturally occurring polysulfanes with human red blood cells, that an hitherto unknown membrane centered mode of action and new interactions with metalloproteins are responsible for (most) of the observed activities. In contrast, the organochalcogen quinoid based redox catalysts act selectively on the cytoskeleton (tubulin/actin), which explains their ability to inhibit selectively the growth of cancer cells. By using a High Content Analysis in different biological models (e.g. cancer cells and Saccharomyces cerevisiae) defined intracellular targets of highly reactive tellurium containing redox catalysts (2-(phenyltellanyl)-3-methylnaphthoquinone and 2,3-bis(phenyltellanyl)naphthoquinone) could be identified for the first time with different state of the art techniques (e.g. kinetic cell-based morphological screening via impedance measurements). The chalcogen based nanoparticles also possess an interesting biological activity (against Steinernema feltiae and Plasmodium falciparum), that is probably based on the special redox behavior of these nanostructures and has to be studied in more detail in the future.
2012-11-08
2017-07-12T07:27:56Z
2012-11-08
2012
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-49903
hdl:20.500.11880/22886
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22830
ger
openAccess
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228872019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
Allosteric modulators directed to the PIF pockets of phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1) and protein kinase C zeta (PKCz)
Allosterische Modulatoren gerichtet gegen die PIF-Tasche der Phosphoinositid-abhängigen Kinase 1 (PDK1) und der Protein Kinase C zeta (PKCz)
Wilhelm, Adriana
Hartmann, Rolf W.
ddc:500
Protein-Serin-Threonin-Kinasen
AGC Kinase
PDK1
PKCz
PIF Tasche
allosterischer Aktivator
allosterischer Inhibitor
AGC kinase
PDK1
PKCz
PIF pocket
allosteric activator
allosteric inhibitor
The phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1), a master kinase in the PI3K signaling pathway, has gained importance as a potential therapeutic target for cancer since several of PDK1’s substrates regulate processes for tumor cell growth and survival. As an alternative to the ATP-competitive strategy, we proposed the regulatory PIF pocket on AGC kinases as a drug target site to develop allosteric inhibitors with greater kinase selectivity. A screening identification of a hit compound and its biological evaluation proved that small molecules can allosterically trigger PDK1 activity by modulating the phosphorylation-dependent conformational transition. The optimization approach yielded 3,5-diarylpent-2-enoic acids whose allosteric mechanism was proven using mutants and cocrystallography. In addition to the SAR study, we applied isothermal titration calorimetry to analyze binding energetics of allosteric activators. Structure-based drug design led to a second compound class containing a dicarboxyl-moiety with improved potency and selectivity. Using a prodrug strategy the cell activity and the proof of mechanism was established. Further structure optimization of 3,5-diarylpent-2-enoic acids provided new insights on inhibition efficacy of small molecules toward the atypical protein kinase C, PKCζ that can occur via binding the PIF pocket. These results demonstrated for the first time, that PIF pocket-directed ligands can be both activators and inhibitors of AGC kinases.
Die Phosphoinositol-abhängige Kinase 1 (PDK1), eine Masterkinase des PI3K Signalweges, stellt ein wichtiges therapeutisches Target für Krebs dar, da viele ihrer Substrate Prozesse der Krebsentstehung regulieren. Mit der Entdeckung der PIF-Tasche wurde ein allosterisches Zentrum der AGC Kinasen für die Entwicklung allosterischer Modulatoren, alternativ zur ATP kompetitiven Strategie, gefunden. Die Identifizierung einer Hitverbindung und deren biologische Evaluierung bestätigten, dass kleine Moleküle die PDK1-Aktivität durch Modulation phosphorylierungs-abhängiger Konformations-übergänge allosterisch triggern können. In einem Optimierungsprozess wurden 3,5-Diarylpent-2-ensäuren synthetisiert und deren allosterischer Mechanismus mit Mutanten und Kokrystallen bewiesen. Zusätzlich zu den Struktur-Wirkungs-Beziehungen wurden mittels isothermaler Titrationskalorimetrie die Bindungsenergien der Aktivatoren bestimmt. Strukturbasiertes Wirkstoffdesign führte zu einer zweiten Verbindungsklasse, wobei mit einer zusätzlichen Carboxylgruppe die Steigerung der Potenz und der Selektivität erreicht wurde. Die Zellaktivität und der Proof of Mechanism der Substanzen konnten mittels einer Prodrug-Strategie bestimmt werden. Eine weitere Strukturoptimierung der 3,5-Diarylpent-2-ensäuren lieferte allosterische Inhibitoren der atypischen Proteinkinase C, PKCζ. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass die PIF-Tasche-Liganden sowohl als Aktivatoren als auch als Inhibitoren der AGC Kinasen fungieren können.
2012-11-12
2017-07-12T07:27:57Z
2012-11-12
2011
2013-02-08
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-49674
hdl:20.500.11880/22887
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22831
eng
openAccess
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oai:publikationen.sulb.uni-saarland.de:20.500.11880/228892019-01-10T07:43:21Zcom_20.500.11880_2col_20.500.11880_3has-source-swb:trueopen_accessdoc-type:doctoralThesisdoc-type:ResearchDatainterface:dnbddc:500ddc:620
The role of fluid dynamics, microstructure and mucociliary clearance in the micro- and macroscopic barrier properties of pulmonary mucus
Die Rolle von Fluid Dynamik, Mikrostruktur und Mukoziliärer Clearance für die mikro- und makroskopische Barrierefunktion von pulmonalem Mukus
Kirch, Julian
Lehr, Claus-Michael
ddc:500
Nanopartikel
Wirkstofffreisetzung
Aerosol
pulmonary drug delivery
nanoparticle
mucus
Major issues in both toxicological as well as pharmaceutical research are biological barriers, impeding the invasion of pathogens but also the delivery of beneficial substances into the body. The upper lungs as site of application of such substances exhibit a particularly efficient biological barrier: the mucus blanket and its mucociliary clearance. The fate of particles upon deposition onto the moving mucus barrier is yet unsolved and was central theme of this work. In this context, mucociliary clearance of nanoparticles and its fluid dynamics were investigated. These results were correlated with the analysis of microscopic and macroscopic particle penetration behavior in mucus and mucus structure. Here, the application of complex methods such as cryoscopic scanning electron microscopy (cryo-SEM), atomic force microscopy (AFM) and optical tweezers revealed the mechanisms of particle mobility in mucus. It could be shown that mucociliary clearance is independent on particle properties such as size, shape, charge or surface chemistry. It was demonstrated that this is due to the only poor particle mobility in mucus: The polymer scaffold of mucus is highly rigid which, in combination with the extensive heterogeneity in pore size, impedes particle translocation. In contrast to model gels and due to this rigidity, particles in mucus which are exposed to external force fields cannot deform or rupture the polymer scaffold of mucus.
Ein zentrales Thema sowohl in der toxikologischen als auch der pharmazeutischen Forschung sind biologische Barrieren, welche die Aufnahme von Krankheitserregern aber auch Pharmazeutika in den Körper erschweren. Die obere Lunge als Applikationsort solcher Substanzen weist eine besonders effiziente biologische Barriere auf: die Mukus-Schicht mit ihrer mukoziliären Clearance. Das Schicksal von Partikeln nach deren Deposition auf der bewegten Mukus-Schicht ist noch ungeklärt und war zentrales Thema dieser Arbeit. In diesem Kontext wurde die mukoziliäre Clearance von Nanopartikeln und deren Fluid Dynamik untersucht. Die Ergebnisse wurden mit der Analyse des mikro- und makroskopischen Penetrationsverhaltens von Partikeln in Mukus und dessen Struktur korreliert. Dabei deckte die Anwendung von Kryo-Elektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und der optischen Pinzette die Mechanismen der Partikelmobilität in Mukus auf. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die mukoziliäre Clearance unabhängig von Partikelgröße, -form, -ladung, oder -oberflächenchemie ist. Es wurde nachgewiesen, dass dies auf die vernachlässigbare Partikelmobilität in Mukus zurückzuführen ist: Das Polymergerüst von Mukus ist hoch rigide, was aufgrund der großen Heterogenität der Porengröße die Partikeltranslokation behindert. Im Gegensatz zu den verwendeten Modell-Gelen und aufgrund dieser Rigidität können Partikel, die einem externen Kraftfeld ausgesetzt sind, das Polymergerüst von Mukus nicht zerstören.
2012-11-22
2017-07-12T07:27:57Z
2012-11-22
2012
doc-type:doctoralThesis
urn:nbn:de:bsz:291-scidok-49921
hdl:20.500.11880/22889
http://dx.doi.org/10.22028/D291-22833
eng
openAccess
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oai_dc///ddc:500/100