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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-6269
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2006/626/


Conditional RNA interference, altered nuclear transfer and genome-wide DNA methylation analysis

Meissner, Alexander

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SWD-Schlagwörter: Kerntransplantation , DNS-Methyltransferase , RNS-Interferenz , Embryonalzelle
Freie Schlagwörter (Deutsch): Kerntransfer , DNA Methylierung , RNAi , Embryonale Stammzellen
Freie Schlagwörter (Englisch): Nuclear transfer , cloning , DNA methylation , RNAi , ES cells
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Walter, Jörn (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.04.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 18.07.2006
Kurzfassung auf Englisch: The goal of the studies described here was to establish a set of methods aimed at ultimately enhancing the efficiency of epigenetic reprogramming. The use of RNA interference (RNAi) for studying and influencing gene function has become an essential part of biology. In this work, we have described two lentivirus-based vectors used for conditional, Cre-lox regulated RNAi in cells and in mice. One vector triggers Cre-dependent activation (pSico) and the other Cre-dependent termination (pSicoR) of shRNA expression. These vectors were used to conditionally and reversibly knock-down p53, Npm, and Dnmt1 expression in ES cells and in MEFs. As a proof of principle, pSico was used to generate conditional and tissue-specific knock-down mice. As outlined in Chapter 1 conditional depletion of various gene products by RNAi will provide better understanding of the factors involved in epigenetic reprogramming. This knowledge should ultimately lead to enhancing the efficiency of successful reprogramming. The pSicoR system was applied in later experiments to temporally suppress Cdx2 function in donor nuclei prior to nuclear transfer, a modification of the current procedure, termed altered nuclear transfer (ANT). Finally, deciphering the epigenome of different cell types is critical for understanding the regulation of both normal development and disease states. In the last part of this work we have devised a new strategy that permits high-resolution comparative DNA methylation analysis. The system was tested in ES cells depleted of DNA methylation by elimination of the DNA methyltransferases Dnmt1, Dnmt3a and 3b. Dnmt1 was knocked down in Dnmt3a and 3b double knockout ES cells using a pSicoR-Dnmt1 vector.
Kurzfassung auf Deutsch: Der Transfer eines differenzierten Zellkerns in eine entkernte Eizelle (Kerntransfer) ist einer von mehreren experimentellen Ansätzen um die Reprogrammierung von differenzierten Zellen zu erreichen. Unter Reprogrammierung vesteht man grundsätzlich die Erweiterung des Entwicklungspotentials einer differenzierten Zelle. Eines der Hauptziele von Kerntransfer-Experimenten ist es undifferenzierte Stamm- oder Vorläuferzellen hervorzubringen, welche für Zellersatztherapien genutzt werden können. Der Hauptvorteil von humanen Kerntransfer-Stammzellen liegt darin, dass sie patientenspezifisch sind und dadurch nicht vom Immunsystem als fremd erkannt würden.
Einer der Schwerpunkte unserer gegenwärtigen Forschung ist es, ein besseres Verständnis der Mechanismen und Faktoren, die in der Kernreprogrammierung involviert sind, zu gewinnen. Die Tatsache, dass vollständig differenzierte Zellen mittels Kerntransfer reprogrammiert werden können, zeigt, das im Verlauf der Entwicklung keine genetische Information verloren geht, d.h. differenzierte Zellkerne enthalten sämtliche Informationen um einen kompletten Organismus hervorzubringen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Regulierung der Differenzierung über epigenetische Mechanismen gesteuert wird. Epigenetische Modifikationen sind stabile Veränderungen der DNA oder des Chromatins, die jedoch die primäre DNA Sequenz nicht verändern. Das Ziel meiner Untersuchen ist es, Methoden und ein besseres Verständnis der involvierten Faktoren zu entwickeln, um den Vorgang der Reprogrammierung verbessern zu können.
Im ersten Teil meiner Arbeit beschreibe ich ein neues System zur Cre-Lox regulierbaren Gen Inhibierung durch RNA Interferenz. Die Effektivität und Funktionalität des Systems wurde für mehrere Gene in vitro und in vivo gezeigt. Neben vielen anderen nützlichen Anwendungen, wie konditionelle Regulierung von essentiellen Genen in vivo, was hier für das Tumorsuppressorgen p53 gezeigt wurde, erlaubt das System transiente Blockierung von Faktoren, die epigenetische Modifikationen regulieren, wie z.B. DNA Methyltransferase 1 (Dnmt1). Es konnte bereits gezeigt werden, dass eine Reduzierung der genomischen DNA Methylierung einen positiven Einfluss auf die Effizienz des Reprogrammierens durch Kerntransfer hat. Allerdings ergeben sich aus der daraus bedingten Hypomethylierung der DNA auch negative Konsequenzen, wie z.B. vermehrtes Auftreten von Tumoren. Diese negativen Auswirkungen lassen sich durch zeitlich beschränkte Inhibierung des Enzyms vermindern, da nach dem Entfernen des RNAi Systems das endogene Gen wieder aktiv ist.
Im zweiten Teil beschreibe ich eine Modifikation der normalen Kerntransfer Technik. Dabei wird eine Gen, mittels des oben beschriebenen RNAi Systems blockiert, was unerlässlich ist für die Differenzierung in Trophectoderm, welches später die Plazenta formt. Dadurch wird kein funktioneller Embryo erzeugt, aber es lassen sich trotzdem Stammzellen gewinnen. Diese Experimente stellen eine wissenschaftliche Basis für die Diskussion über die Gewinnung von Stammzellen dar, und erlauben ausserdem weitere Analysen von essentiellen Faktoren die für die extraembryonalen Gewebe notwendig sind. Dies ist wichtig, da viele essentielle Gene im geklonten Embryo selbst, aber auch in seinen extraembryonalen Teilen, nicht korrekt reaktiviert werden.
Obwohl die DNA Sequenz zwischen Stammzellen und differenzierten Zellen identisch ist, sind sie epigentisch verschiedenen. Um diese Unterschiede im gesamten Genom besser untersuchen zu können, haben wir eine Methode entwickelt, die es erlaubt grosse Teile des Epigenoms zu analysieren und zwischen verschiedenen Zelltypen zu vergleichen.

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