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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-10733
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2007/1073/


Hybridinhibitoren der humanen 5-alpha-Reduktase : ein neues Konzept zur Hemmung der 5-alpha-Reduktase Isoenzyme Typ I und Typ II

Hybrid inhibitors of human 5-alpha-reductase : a new concept for the inhibition of 5-alpha-reductase isoenzymes type I and type II

Streiber, Martina

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SWD-Schlagwörter: Enzym , Enzyminhibitor , Pharmakokinetik , Ester , Hydrolyse , Prostatakrebs
Freie Schlagwörter (Deutsch): 5-alpha-Reduktase , Benigne Prostatahyperplasie , Esterhydrolyse , Duale Inhibitoren
Freie Schlagwörter (Englisch): 5-alpha-reductase , benign prostatic hyperplasia , prostate cancer , hydrolysis of esters , dual inhibitors
Institut: Fachrichtung 8.2 - Pharmazie
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hartmann, Rolf W. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.03.2007
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 19.03.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Erhöhte DHT-Spiegel korrelieren mit der Pathogenese und Progression androgenabhängiger Erkrankungen wie Prostatakrebs und benigner Prostatahyperplasie (BPH). Die irreversible Reduktion von T zu DHT stellt den letzten Schritt in der Androgenbiosynthese dar und wird von den beiden Isoenzymen 5-alpha-Reduktase 1 (5aR1) und 5-alpha-Reduktase 2 (5aR2) katalysiert. Zur Therapie der BPH werden deshalb 5aR Inhibitoren erfolgreich eingesetzt. Der Nutzen von 5aR Hemmstoffen zur Prävention von Prostatakrebs oder dessen Behandlung in Kombination mit Antiandrogenen wird zur Zeit in verschiedenen klinischen Studien untersucht. Dabei hat sich generell die Hemmung beider 5aR Isoenzyme als vorteilhafter erwiesen. Auf dem Arzneimittelmarkt sind nur 2 steroidale 5aR Hemmstoffe zugelassen, Finasterid und Dutasterid, wobei es sich nur bei letzterem um einen dualen Hemmstoff handelt. Wegen der unerwünschten Nebenwirkungen dieser 5aR Hemmstoffe, die mit der steroidalen Struktur einhergehen könnten, wurden in unserem Arbeitkreis nicht steroidale Inhibitoren entwickelt, die möglichst auch eine dualen Hemmung aufweisen sollten.
Potente, nicht steroidale 5aR2 Inhibitoren (4-[1-(2,2-Dicyclohexyl-acetyl)-piperidin-4-ylidenmethyl]-benzoesäuren) wurden auf Selektivität gegenüber der 5aR1 getestet werden. Dazu wurde ein Assay mit DU145 Zellen (humane Prostatakarzinom-Zellen, die 5aR1 exprimieren) verwendet, in dem die Substanzen keine Hemmung zeigten. Allerdings konnte für die Verbindungen eine schlechte Permeation in DU145 Zellen nachgewiesen werden, die wahrscheinlich mit der bei physiologischem pH-Wert deprotonierten Carbonsäure-Struktur in Zusammenhang steht. Um diese negative Ladung zu umgehen, wurde ein Konzept entwickelt, bei dem die korrespondierenden Methylester als zellpermeable Prodrugs eingesetzt wurden.
Um künftig solche Permeationseinflüsse im verwendeten Testsystem für die 5aR1 zu umgehen, wurde ein zellfreier DU145 Assay entwickelt. Interessanterweise zeigten nun die Methylester eine eigene Hemmwirkung am freien Isoenzym 1, was sie nicht nur zu Prodrugs der 5aR2 aktiven Säuren macht, sondern auch gleichzeitig zu Inhibitoren der 5aR1.
Aus dieser besonderen Art der dualen Hemmung beider 5aR Isoenzyme wurde nun ein völlig neues Hybridinhibitor-Konzept entwickelt. Der Ester sollte als Precursor für die korrespondierende Säure und gleichzeitig als selektiver Inhibitor der 5aR1 dienen und daher während seiner Absorption und Verteilung im menschlichen Körper hydrolyse-stabil sein. Dann wäre er in der Lage die ubiquitär vorkommende 5aR1 zu hemmen. Nach Erreichen des Target-Organs, der Prostata, musste der Ester gut in die Zellen aufgenommen werden, um dann von Enzymen der Prostata hydrolysiert zu werden und intrazellulär die korrespondierende Carbonsäure als aktiven Metaboliten freizusetzen. Diese wiederum sollte als potenter und selektiver 5aR2 Inhibitor wirken. Neben guten Hemmwerten der Säuren für die 5aR2 und der Ester für die 5aR1 mussten letztere also noch zusätzlich ein gutes Verhältnis zwischen hydrolytischer Stabilität und Labilität aufweisen.
Zahlreiche Voraussetzungen müssen also erfüllt sein, damit Substanzen als sogenannte Hybridhemmstoffe wirken können. Deshalb wurde eine komplexe in vitro Teststrategie aufgestellt. Um gut vergleichbare Hemmwerte für die 5aR Isoenzyme zu erhalten, wurden ausgehend von den in unserem Arbeitskreis etablierten Zelllinien HEK-I und HEK-II zwei zellfreie Assays entwickelt. Die HEK-I und HEK-II. Wenn nun die Carbonsäure gute Hemmwerte im HEK-II zellfreien Assay zeigte und der korrespondierende Ester ein potenter 5aR1 Inhibitor war, wurden anschließend Stabilitätsuntersuchungen durchgeführt. Dabei musste der Ester zunächst eine ausreichende Hydrolyse-Stabilität in Puffer aufweisen. In Caco-2 Zellhomogenat, das als Modell für den GIT diente, sollte der Ester ebenfalls stabil sein. Die Distribution eines Stoffes erfolgt vor allem über den Blutkreislauf, weshalb auch die Stabilität des Esters in humanem Plasma beobachtet wurde. In BPH-Gewebehomogenat hingegen sollte der Ester von Hydrolasen der Prostata in die 5aR2 aktive Säure gespalten werden. Um schließlich noch die Zellgängigkeit der Ester, die ursprünglich als Prodrugs entwickelt wurden, zu untersuchen, wurde ein Permeationsassay mit den humanen Prostatakarzinom-Zellen DU145 als Modell für die Target-Zellen entwickelt.
Mit Hilfe der beschriebenen Teststrategie wurden potenten und nicht-steroidalen Hybridhemmstoffe der 5aR1 und 5aR2 entdeckt und es konnte ein völlig neuartiges Konzept zur dualen Hemmung beider 5aR Isoenzyme entwickelt werden. Nach Verabreichung eines zellpermeablen Esters, der hydrolytisch stabil gegenüber intestinalen und Plasma-Esterasen ist, kann dieser selektiv die ubiquitär vorkommende 5aR1 hemmen. Im Target-Organ angekommen, wird er von Hydrolasen der Prostata gespalten und kann so intrazellulär die korrespondierende Carbonsäure als potenten 5aR2 Inhibitor freisetzen.
Kurzfassung auf Englisch: Elevated DHT levels correlate with the pathogenesis and progression of androgen-dependent diseases such as prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH). The irreversible reduction of T to DHT represents the final step in androgen biosynthesis and is catalysed by two isoenzymes, 5-alpha-reductase 1 (5aR1) and 5-alpha-reductase2 (5aR2). Therefore 5aR inhibitors were successfully used to treat BPH. Currently, the therapeutic efficacy of 5aR inhibitors for the prevention of prostate cancer or for treating PCa in combination with antiandrogens should be proved in several clinical studies.In general, the inhibition of both isoenzymes showed to be more advantageous. On the pharmaceutical market, only 2 steroidal 5aR inhibitors are available, Finasteride and Dutasteride, whereas mere the latter is capable to act as dual inhibitor. Due to undesirable side effects of these inhibitors that are believed to be caused by its steroidal structure, non steroidal compounds were synthesised within our working group exhibiting potential dual inhibition.
Potent, non steroidal 5aR2 inhibitors ((4-[1-(2,2-Dicyclohexyl-acetyl)-piperidine-4-ylidenemethyl]-benzoic acids, compounds 1-3) were tested for selectivity against 5aR1. As a test system, we used DU145 cells (human prostatic carcinoma cells expressing 5aR1). Here the human type 2 inhibitors showed poor inhibitory activities. However, these compounds exhibited little permeation in DU145 cells probably because of the deprotonated carboxylic acid moiety at physiological pH. To overcome this limitation a concept was developed to use the corresponding methyl esters (1a-3a) as cell permeable prodrugs.
In order to avoid such permeation influences in our 5aR1 test system, a cell free assay method using DU145 was developed. Interestingly enough, methyl esters themselves displayed inhibitory activities against 5aR1. Esters were not only prodrugs for the corresponding carboxylic acids, but in addition inhibitors toward 5aR1.
Starting with this special kind of dual inhibition of both 5aR isoenzymes, a new hybrid inhibitor concept was developed. The methyl ester serving as precursor for the corresponding acid and at the same time being a selective 5aR1 inhibitor should be stable against hydrolytic enzymes during absorption and distribution in human body. Thus, the compound should be able to inhibit the ubiquitous isoenzyme 1. After reaching the target organ, the prostate, the methyl ester should easily permeate the cells to be hydrolysed by prostatic enzymes and to release the corresponding carboxylic acid as active metabolite intracellular. The acid again could act as potent and selective 5aR2 inhibitor. Besides good inhibitory activities of carboxylic acids toward 5aR2 and of esters toward 5aR1, the latter had to show additionally a good ratio of hydrolytic stability and instability.
Several conditions must be fulfilled that compounds could act as hybrid inhibitors. Within the scope of the development of new inhibitors a complex in vitro test strategy was established. To obtain well comparable inhibition data for both isoenzymes and in addition a high throughput of compounds, two cell-free assays were developed using HEK-I and HEK-II cells transfected with either human 5aR1 or 5aR2. Assays were optimised with respect to substrate concentration, incubation time and protein content. If the carboxylic acid showed good inhibitory activities in the HEK-II cell-free assay and the corresponding ester was a potent 5aR1 inhibitor, stability tests were performed in several biological media. First, esters had to be stable in buffer pH 7.4. In Caco-2 cell homogenate serving as model for the gastro-intestinal tract, the ester should also show adequate hydrolytic stability. Distribution of drugs is particularly due to blood circulation. Therefore ester stability was monitored in human plasma. However in BPH tissue homogenate, prostatic enzymes should cleave the ester into the corresponding acid being able to selectively inhibit 5aR2. Finally, a cell permeation assay was developed to determine the absorption in target cells. Human prostatic carcinoma cell line DU145 was used as a model for the target cells.
By means of this evolved test strategy, potent non steroidal hybrid inhibitors of 5aR1 and 5aR2 could be developed as well as a completely new concept for dual inhibition of 5aR isoenzymes. Application of a cell permeable ester that is hydrolytic stable against intestinal and plasma esterases will lead to a selective inhibition of 5aR1. After reaching the target organ, the ester will be hydrolysed by prostatic enzymes and will yield intracellular the corresponding carboxylic acid that will act as selective and potent 5aR2 inhibitor.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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