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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-9128
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2007/912/


Identifizierung essentieller Komponenten des intrazellulären Transports eines viralen A/B-Toxins der Hefe

Identification of the intracellular transport system of a viral A/B-toxin in yeast

Sendzik, Tanja

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SWD-Schlagwörter: Saccharomyces cerevisiae , Hefeartige Pilze , Intrazellulärer Transport , Toxin , Ubiquitin , Endocytose
Freie Schlagwörter (Deutsch): Hefe, Killertoxine, ERAD, Ubiquitinierung , Rezeptor-vermittelte Endozytose
Freie Schlagwörter (Englisch): yeast , ERAD , intracelluar transport , killertoxins , receptor-mediated endocytosis
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schmitt, Manfred J. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.12.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 07.03.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Die Hefe Saccharomyces cerevisiae sezerniert das von dsRNA Viren kodierte, heterodimere K28-Toxin in das sie umgebende Medium und ist somit in der Lage, Hefen derselben oder einer anderen Gattung abzutöten. Der als Präprotoxin (pptox) vorliegende Toxinvorläufer wird posttranslational in das ER-Lumen transportiert und nach Abspaltung der Signalsequenz werden die beiden Untereinheiten des reifen Toxins, α und β, durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Die Toxinaufnahme durch sensitive Zielzellen erfolgt über rezeptorvermittelte Endozytose, an deren Anschluss K28 retrograd über Golgi und ER bis auf die Stufe des Zytosols transportiert wird. Die Retrotranslokation aus dem ER erfolgt über den Sec61-Komplex der ER-Membran. Im Zytosol dissoziiert das α/β-Heterodimer in seine Toxinuntereinheiten, β wird ubiquitiniert und proteasomal abgebaut, während die zytotoxische α-Komponente mittels passiver Diffusion in den Zellkern gelangt und einen Zellzyklusarrest am G1/S-Übergang induziert. In der vorliegenden Arbeit wurden vier Themenschwerpunkte bearbeitet, die sich mit der intrazellulären Expression toxischer K28α-Derivate und deren intrazellulären Transportroute beschäftigten.
(1) Im Rahmen einer Transposon(mTn3)-Mutagenese konnten überwiegend nicht-essentielle Hefeproteine als potentielle Interaktionspartner der beiden toxischen α-Varianten α(SS/R) und α(NLS/R) identifiziert werden: APL3, CWP2, IRA2, PFK26, PRP6, RNH203 und ZWF1. Die toxischen α-Varianten wurden in den jeweiligen knock-out-Mutanten der betreffenden Gene intrazellulär exprimiert und zusätzlich gegen exogen appliziertes K28-Toxin getestet. Es stellte sich heraus, dass die beiden Proteine Prp6p und Apl3p potentielle Interaktionspartner von α darstellen könnten. Das Gen PRP6 wurde anhand des Konstruktes α(NLS/R)identifiziert. PRP6 kodiert den RNP(U4/U6)-assoziierten Spleißfaktor Prp6p, der am prä-mRNA-Spleißen beteiligt ist und sich in der Kernmatrix befindet. Prp6p könnte somit mit K28α im Kern in direkte Wechselwirkung treten, was die Theorie des Kernimportes unterstützt. Die Mutation des Genes ist letal, weshalb das Protein nicht weiter untersucht wurde, da keine Expressionsstudien damit durchgeführt werden konnten. Des Weiteren wurde mit α(NLS/R) das Gen APL3 identifiziert, was einen Hinweis auf einen gerichteten Kernimport von K28α lieferte. Bei Apl3p handelt es sich um einen Teil des an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligten AP2-Komplexes. Apl3p durchläuft ein nukleoplasmatisches "Shuttling". Auf dem Weg in den Zellkern könnte es mit der α-Untereinheit interagieren und eventuell dessen Import in den Nukleus erleichtern; alternativ wäre eine Interaktion nach passiver Diffusion von α(NLS/R) im Nukleus möglich. Interessanterweise verhielt sich die Δapl3-Mutante auch resistent gegen exogen appliziertes Toxin. Diese Resistenz beruht jedoch nicht auf einem Defekt der endozytotischen Toxin-Aufnahme (das Toxin war im Zytosol nachweisbar), sondern manifestiert sich vermutlich weiter "downstream", da sich die Mutante auch resistent gegen die Expression von α(SS/R) im ER verhielt.
(2) Mit Hilfe eines Mutanten-Screenings konnte untermauert werden, dass α(SS/R) in den Sekretionsweg der Zelle eingeschleust wird und die Signalpeptidaseaktivität im ER eine entscheidende Rolle für die Retrotranslokation und Toxizität spielt. Darüber hinaus wurden deutliche Hinweise dafür erbracht, dass α(SS/R) bis auf die Stufe des Golgi gelangt und anschließend wieder retrograd zum ER transportiert wird, was aus der Resistenz der Mutanten Δkex1, Δerv29, Δerv46, Δerv41, Δemp24, Δemp46 und Δbst1 nach intrazellulärer Expression von α(SS/R)gezeigt werden konnte. Zwei Möglichkeiten sind somit beim intrazellulären Transport der α-Untereinheit denkbar: α wird nach Erreichen des Golgi wieder retrotransportiert und aus dem ER in das Zytosol transloziert; im Zytosol angekommen, erfolgt eine passive Diffusion in den Kern, der eventuell eine Interaktion von α mit zytosolischen Proteine vorausgeht. Hinweise darauf lieferten die Nukleoporinmutanten Δnup60, Δnup84 und Δgfd1, die nach intrazellulärer Expression von α(SS/R) und α(NLS/R) resistent waren oder lediglich ein leicht verzögertes Wachstum zeigten. Eine weitere Alternative wäre, dass α im Fall von α(SS/R) direkt vom Golgi das Zytosol erreicht.
(3) Der intrazelluläre Nachweis der K28α-Untereinheit konnte erstmals anhand einer cmyc-markierten Toxinvariante (α(R)cmyc) erbracht werden. Die in vivo toxischen Varianten α(SS/R)cmyc und α(NLS/R)cmyc wurden weder im Zellaufschluss noch im Kulturüberstand nachgewiesen. Die durchgeführten Versuche ließen in Übereinstimmung mit den Mutantenanalysen den Schluss zu, dass α(SS/R) in den Sekretionsweg geschleust werden muss, um seine toxische Wirkung entfalten zu können; α(NLS/R) hingegen gelangt aufgrund der NLS direkt in den Kern; übereinstimmend hiermit war α(R) nicht mehr toxisch. (4) Der Austausch aller Lysinreste innerhalb von K28pptox gegen Arginine lieferte K28—Derivate mit einer verminderten Sekretionsrate und einer dadurch bedingten verminderten Toxizität. Die Lysin-freien Varianten waren jedoch in der Lage, den Zellen eine protektive Immunität zu verleihen. Eine Erhöhung der Toxizität war in den K-0 Varianten von K28 nicht zu beobachten, so dass eine Ubiquitinierung bei der Vermittlung der Toxizität keine Rolle spielt.
Kurzfassung auf Englisch: K28 killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae secrete a heterodimeric killer toxin (K28) which is genetically encoded by dsRNA viruses persisting within the cytosol. The toxin kills sensitive strains of the same or related genera by cell-cycle inhibition. The toxin precursor (preprotoxin, pptox) is postranslationally imported into the ER. On its intracellular transport route through ER and Golgi, the pptoxsignal sequence is proteolytically cleaved within the ER, and the α- and β-subunits of the mature toxin are covalently linked by a single disulfide bridge. Toxin uptake by a sensitive target cell resembles receptor-mediated endocytosis followed by retrograde transport via Golgi and ER and translocation into the cytosol through the major ER-import and -export channel Sec61p. Within the cytosol, the two subunits dissociate, β is ubiquitinated and proteasomally degraded, while α diffuses into the nucleus and induces a cell cycle arrest at the G1/S-boundary. The located HDEL-sequence is responsible for the endocytotic uptake and represents a classical ER retention signal which is recognized and bound by the HDEL-receptor Erd2p of the target cell. The subjects being worked on within this thesis cope with the intracellular expression and transport of certain toxic K28α-variants. The method of mTn3-mutagenesis was supposed to shed light onto intracellular interaction partners of the K28α-subunit. These partners should be investigated with respect to their cellular function. Moreover, an intensive mutant screening should show which compartments and modifications are necessary to confer α into its cytotoxic conformation. We also tried to detect the α-subunit intracellularly and in the supernatant. We asked whether there is any difference between the intracellular way the toxic subunit takes and the way "normal'; toxin follows when exogenously applied. Finally we focused on different toxin variants that were modified by the exchange of their lysine residues against arginine to analyze the effect of ubiquitination on toxin retrotranslocation and in vivo toxicity.
(1) By transposon(mTn3)mutagenesis several yeast genes could be identified whose gene products might be potential interaction partners of the suicidal α-variants α(SS/R) and α(NLS/R): APL3, CWP2, IRA2, PFK26, PRP6, RNH203 and ZWF1. The lethal α-derivatives were expressed in each knock-out mutant and, additionally, each mutant was tested for sensitivity/resistance against extracellularly applied K28-toxin. After intracellular expression of the two α-variants, Apl3p and Prp6p were identified as potential interaction partners of α. Prp6p is an essential gene product that plays a role within the snRNP(U4/U6)-associated splicing factor located in the nuclear matrix and involved in pre-mRNA-splicing. It is< known that Prp6p interacts with a wide range of proteins, including the ubiquitin ligase Ubc9p, and it might be possible that Prp6p interacts with K28α in the nucleus, supporting the necessity of nuclear import for in vivo toxicity of K28. Besides Prp6p, another yeast protein (Apl3p) could be identified as possible interaction partner of α(NLS/R) and α(SS/R). As of the AP2-complex, Apl3p is associated with the clathrin dependent endocytosis machinery. Apl3p undergoes a nucleoplasmatic shuttling and therefore could interact with α on its way to the nucleus and facilitate its nuclear import; alternatively, an interaction could take place within the nucleus. Interestingly, a Δapl3-knock-out was not only resistant against the intracellular expression of either α(NLS/R) or α(SS/R) but also against exogenously applied toxin. Toxin resistance in a Δapl3-mutant was not caused by a defect in endocytic toxin uptake, since toxin was detectable in the cytosol of toxin-treated mutant cells. Thus, its resistance is likely to be manifested downstream from endocytosis, presumably within the nucleus.
(2) Phenotypic analysis of various yeast mutants strongly indicated that α(SS/R) is transported into the ER lumen where signal peptidase processing is crucial for the in vivo toxicity of α. Furthermore, strong evidence was obtained that the variant α(SS/R) even reaches the Golgi compartment from where it is transported retrograde back to the ER. The following yeast knock-out mutants showed complete resistance against the intracellular expression of lethal K28α-variants: Δkex1, Δerv29, Δerv46, Δerv41, Δemp24, Δemp46 and Δbst1. Thus, two possible intracellular transport routes for K28α can be postulated: either α is transported from the Golgi back to the ER and thereafter into the cytosol from where it diffuses into the nucleus to kill a cell. Such a pathway is supported by the observed toxin resistance in the yeast nucleoporine mutants Δnup60, Δnup84 and Δgfd1 after intracellular expression of either α(SS/R) or α(NLS/R). Alternatively, α(SS/R) directly translocates from the Golgi to the cytosol to reach the nucleus.
(3) For the first time, after expression of a cmyc-tagged, non-toxic α-variant (α(R)cmyc) the subunit could be detected by western analysis. Neither the toxic variant α(SS/R)cmyc nor α(NLS/R)cmyc could be detected within the cell cytosol or in the cell-free culture supernatant. These tests, in addition to the mutant screen, also showed that α(SS/R) has to gain access to the secretory pathway in order to be converted into its cytotoxic conformation; in contrast, α(NLS/R) directly enters the nucleus via its NLS.
(4) Substitution of all internal lysine residues within K28pptox by arginines resulted in a toxin variant that was still in vivo toxic and capable to translocate from the ER into the cytosol, while immunity of lysine-free pptox was negatively affected. Therefore it can be concluded that ubiquitination is neither involved in ER exit nor in in vivo toxicity of K28.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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