Examination of the penetration behavior of pharmaceutical drugs on the eye and set-up of an in virto cell model for ocular drug delivery

Abstract

The focus of this thesis was to find a simple test system to screen new therapeutic entities to regarding their ocular penetration. Using the model compound moxaverine-hydrochloride, the project was performed in 4 phases:

In phase 1, the tissue distribution of moxaverine-hydrochloride in the rabbit eye was examined and evaluated. A distribution profile was generated by either dosing pigmented Dutch-belted rabbits topically on the eye or applying the drug solution intravenously. Results showed that high drug amounts in the posterior part of the eye can be achieved after pre-corneal disposition of the moxaverine-solution. The fact that blood-plasma levels of moxaverine-hydrochloride did not exceed the levels found after systemic dosing makes local ocular administration of moxaverine-hydrochloride an interesting therapeutic approach. Parallel to the in vivo testing, the barrier that corneal epithelium exhibits towards moxaverine-hydrochloride was examined using a primary rabbit corneal epithelial cell culture (rbCECL). These in vitro drug transport studies confirmed that the rabbit cornea does not represent a critical barrier for moxaverine-penetration into the eye.

Phase 2 of the presented project dealt with the development of a primary human corneal epithelial cell model. The methods mainly concentrated on various enzymatic digestions, using proteases and combination of these enzymatic techniques with a cell positive selection protocol using magnetic microbeads coated with human epithelial antigen (CD327, HEA-125). Even though the experimental conditions were varied intensively and numerous combinations of enzymes were examined, the aim of the primary human corneal epithelial cell culture was not reached. The limited amount of available tissue and the long storage time of the corneal samples after excision might contribute to the failure of this part of the work.

Since a primary human corneal epithelium was out of reach as an in vitro test system, existing models of human corneal epithelium were examined and compared to intact human and rabbit cornea (phase 3 of the thesis). The cell models under investigation were all of human origin and immortalized by either SV-40 large T antigen or a recombinant retrovirus containing HPV16 genes E6 and E7. The cell models were examined by a spectrum of marker-substances for their power to differentiate (high/low permeability markers), presence and activity of P-glycoprotein efflux systems (using substrate molecules), and value for ophthalmic research ("ophthalmology marker';). The systems were also used to screen the substance of interest, moxaverine-hydrochloride. Using a set of marker substances, a ranking of the models was created. The commercially available reconstituted human corneal epithelium from Skinethic (Nice, France) showed a poor performance in this study, even though it serves as a valuable tool in toxicity and eye irritation testing. The likewise commercially available Clonetics system from Cambrex as well as the long established HCE-T cell line proved to be good simplified models of the cornea. Drawbacks for the HCE-T cell line, however, is the less pronounced power of differentiation and the findings made in stage 4 of the project (see below).

In the final, fourth phase of the project, the HCE-T cell line was compared to the human cornea regarding its equipment with common efflux transporters. Since efflux systems of the ABC-transporter family are known to be a crucial factor in drug disposition and failure in cancer therapy, these proteins have gained major interest in biopharmaceutical research. To clarify the situation in corneal epithelium that has not been extensively reviewed so far, we examined the presence of MDR1/P-gp, MRP1, MRP2, LRP, and BCRP in ex vivo human corneal samples and the commonly used HCE-T cell line. RT-PCR and immunofluorescence microscopy, as well as immunoblotting were used as tools to assess the spectrum of transporters. Human cornea proved to be a rather uncritical tissue concerning multi-drug resistance issues, showing only a little array of efflux proteins, namely only LRP, HCE-T, however, showed a broader spectrum of efflux proteins, not unexpected in a continuously growing cell line that highly differs from the situation found ex vivo.

In dieser Arbeit sollte ein einfaches Testsystem gefunden werden, um das oculare Penetrationsverhalten neuer therapeutischer Substanzen vorhersagen zu können. Unter Verwendung der Modellsubstanz Moxaverin-Hydrochlorid wurde das Projekt in 4 Abschnitten durchgeführt:

In Phase 1 wurde die Gewebeverteilung von Moxaverin-Hydrochlorid im Kaninchenauge ermittelt und bewertet. Ein Verteilungsprofil wurde erstellt, indem pigmentierte Kaninchen der Rasse "dutch-belted'; eine Wirkstofflösung entweder lokal am Auge oder intravenös verabreicht wurde. Die Resultate zeigten, daß hohe Substanzmengen im hinteren Teil des Auges nach precornealer Verabreichung der Moxaverinlösung erreicht werden können. Die Tatsache, daß die Blutplasma-Spiegel des Moxaverin-Hydrochlorids die der systemischen Gabe nicht überstiegen, macht die lokale, okulare Gabe von Moxaverin-Hydrochlorid zu einer interessanten Therapiemöglichkeit für die vom Koopertionspartner vorgesehene Anwendungsgebiete. Parallel zur in vivo Testung wurden die Barriereeigenschaften des Korneaepithels gegenüber Moxaverin-Hydrochlorids mit einer primären Epithelzellkultur der Kaninchenkornea (rbCECL) überprüft. In vitro Arzneistofftransportstudien zeigten, daß das Kaninchenhornhautepithel keine kritische Barriere für die Moxaverinpenetration in das Auge darstellt.

Phase 2 der Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung eines primären humanen Korneaepithelzellmodells. Die angewandten Techniken bestanden hauptsächlich aus enzymatischen Verdau mittels verschiedener Proteasen, die bereits in der Literatur beschrieben wurden. Diese wurden mit einem Zell-Aufreinigungsverfahren kombiniert, das sich magnetischer Microbeads bedient. Diese sind mit einem menschlichem Epithelantigen (CD326, HEA-125) beschichtet und besitzen die Möglichkeit, spezifisch an humane Epithelzellen zu binden. Obwohl die experimentellen Bedingungen immer wieder variiert wurden und verschiedene Isolationstechniken kombiniert wurden, konnte das gesetzte Ziel der primären menschlichen Korneaepithelzellkultur nicht erreicht werden. Die begrenzte Menge des vorhandenen Gewebes und die lange Kulturzeit der Korneaproben nach Entnahme aus dem Spender trugen hierbei massgeblich zum Misslingen dieses Teils der Arbeit bei.

Da ein primäres menschliches Korneaepithel als in vitro Testsystem nicht verfügbar war, wurden bereits etablierte Modelle für das menschliche Korneaepithel mit intakter Menschen- und Kaninchenhornhaut verglichen (Abschnitt 3 des Projekts). Alle untersuchten Zellmodelle waren menschlichen Ursprungs und durch das SV-40 large T Antigen oder ein recombinantes Retrovirus, das die HPV16 Gene E6 und E7 enthielt, immortalisiert. Die Zellmodelle wurden mit einem Spektrum von Testsubstanzen auf ihre Differenzierungskapazität (hoher/niedriger Permeabilitätsmarker), das Vorhandensein von P-gp Effluxsystemen (mittels Substrattransportes) und Wert für die Augenforschung ("Ophthalmologiemarker") überprüft. Die Systeme wurden weiterhin als Screen für die Modellsubstanz, Moxaverin-Hydrochlorid, benutzt. Mittels dieser Markersubstanzen wurden die Zellmodelle klassifiziert. Das käuflich erhältliche rekonstituierte menschliche Korneaepithel von Skinethic (Nizza, Frankreich) zeigte nur eine niedrige Differenzierungsleistung, obwohl es ein wertvolles Testsystem im Bereich Augenreizung und Toxizitätsstudien darstellt. Das ebenfalls kommerziell erhältliche Clonetics System von Cambrex und die etablierte HCE-T Zelllinie waren gute vereinfachende Modelle der Hornhaut. Die HCE-T Zelllinie zeigte allerdings weniger ausgeprägte Unterscheidungskraft als das Clonetics System und die Resultate die in Phase 4 des Projektes (siehe unten) gefunden wurden, führten zu einer weiteren Rückstufung des Modells.

In der letzten, vierten Stufe dieser Arbeit wurde die HCE-T Zelllinie mit der menschlichen Hornhaut bezüglich der wichtigsten bekannten Effluxsysteme verglichen. Da die Effluxsysteme der ABC-Transporterfamilie sich als entscheidender Faktor in der Arzneistoffabsorption über biologische Barrieren herausgestellt haben und auch eine entscheidende Rolle in der Resistenzbildung von Tumoren in der Krebstherapie spielen ("mulit-drug resistance"), haben diese Proteine ein grosses Interesse in der biopharmazeutischen Forschung geweckt. Da es zum Expressionsmuster der ABC-Transporter in der menschlichen Hornhaut nur wenige und zudem widersprüchlich Aussagen gibt, wurde das Vorhandensein und die Aktivität von MDR1/P-gp, MRP1, MRP2, LRP und von BCRP in Humankornea mit in der vielgenutzten HCE-T Zelllinie verglichen. RT-PCR und Immunofluoreszenzmikroskopie, sowie Immunoblotting wurden hierbei als Methoden benutzt. Menschliche Hornhaut stellte sich hierbei als ein ziemlich unkritisches Gewebe bezüglich multidrug-resistance Proteinen dar und zeigte ein sehr eingeschränktes Spektrum an Effluxproteinen (LRP). HCE-T Zellen stattdessen besitzen ein breites Spektrum von Effluxtransportern, das sich in hohem Grade von der in vivo Situation unterscheidet.