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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-15905
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2008/1590/


Charakterisierung von Substraten der Rezeptoren des nukleocytoplasmatischen Transports in Saccharomyces cerevisiae

Characterisation of subtrates of the receptors of the nucleocytoplasmic transport in Saccharomyces cerevisiae

Zengerly, Iris

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SWD-Schlagwörter: Kernproteine , Saccharomyces cerevisiae
Freie Schlagwörter (Deutsch): nukleocytoplasmatisch , Transport , Rfc2 , Importin alpha , Importin beta
Freie Schlagwörter (Englisch): nucleocytoplasmic , transport , Rfc2 , Importin alpha , Importin beta
Institut: Fachrichtung 2.3 - Medizinische Biochemie und Molekularbiologie
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Zimmermann, Richard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 29.05.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Der Transport von Proteinen und RNA in und aus dem Zellkern erfolgt in der Hefe Saccharomyces cerevisiae mit Hilfe von 14 löslichen Importin beta-homologen Transportrezeptoren und einigen weiteren Faktoren, die den Ablauf der Translokation unterstützen. In dieser Arbeit wurden die Importrezeptoren Kap95, Kap114 und Kap120, daneben der Exportfaktor Cse1 sowie das Adapterprotein Srp1 und der GTPase-Koaktivator Yrb1 biochemisch bzw. molekularbiologisch untersucht. In vitro wurden diverse Interaktionspartner für diese Proteine detektiert. Insbesondere die Replikationsfaktor C-Untereinheit Rfc2 wurde als Substrat für den heterodimeren Importkomplex Srp1/Kap95 (Importin alpha/Importin beta) näher charakterisiert. Dieser Komplex schleust typischerweise Substrate mit einer basischen Kernlokalisierungssequenz über den Kernporenkomplex in den Zellkern, wo er unter Mitwirkung von Gsp1-GTP und Nup2 disassembliert. Rfc2 wurde zunächst als endogener Komplex mit Kap114 aus Hefe-Cytosol isoliert. Da jedoch die Deletion des KAP114-Gens in der Zelle keine Wirkung auf den nukleären Import des Proteins zeigte, wurde in Bindungsstudien mit rekombinant in E. coli hergestellten und gereinigten Proteinen die Affinität dieses Substrates zu verschiedenen Importrezeptoren untersucht. Es zeigten sich schwache bis mäßig starke Interaktionen zwischen Rfc2 und Kap114, Nmd5, Kap120, Kap95, Pse1, Kap104 sowie Sxm1. Die Zugabe von Srp1 zu Kap95 verstärkte die Bindung. In verschiedenen temperatursensitiven SRP1- und KAP95-Hefe-Mutanten wurden in vivo Defekte im Import von Rfc2 nachgewiesen. Vier basischen Aminosäureresten im N-terminalen Bereich wurden als eine monopartite klassische Kernlokalisierungssequenz identifiziert.
Kurzfassung auf Englisch: In the yeast Saccaromyces cerevisiae proteins and RNAs are transported into and out of the nucleus by fourteen soluble Importin beta-homologous transport receptors and some further supporting factors. In this work the import receptors Kap95, Kap114 and Kap120, the export factor Cse1, the adaptor molecule Srp1 and the GTPase coactivator Yrb1 were examined in a biochemical and molecularbiological manner. Different interaction partners of these proteins were detected in vitro. Especially the replication factor C subunit Rfc2 was examined in more detail as a substrate for the heterodimeric import complex Srp1/Kap95 (Importin alpha/Importin beta). This complex typically channels a substrate with a basic nuclear localization signal through the nuclear pore complex into the nucleus, where it disassembles under the influence of Gsp1-GTP and Nup2. First Rfc2 was isolated in an endogenous complex with Kap114 from yeast cytosolic fraction. Deletion of the KAP114 gene did not show any effect on the nuclear import of the protein, so that its affinity to different import receptors was investigated in binding studies with recombinant and purified proteins from E. coli. Weak to moderate interactions between Rfc2 and Kap114, Nmd5, Kap120, Kap95, Pse1, Kap104 as well as Sxm1 have been shown. The addition of Srp1 to Kap95 increased the interaction. When SRP1 and KAP95 genes were mutated in yeast cells, the temperature sensitive strains showed defects in import of Rfc2. Four basic amino acid residues were identified as a monopartite classical nuclear localization signal.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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