Two-dimensional reversed-phase liquid chromatography coupled to MALDI TOF/TOF mass spectrometry : an approach for shotgun proteome analysis

Abstract

Large-scale proteome analysis of complex biological mixtures requires high resolving power separations, high-throughput mass spectrometry and accurate detection, and bioinformatics tools. In the present work LC-MALDI TOF/TOF mass spectrometry was combined for the first time with a two-dimensional separation based on reversed-phase chromatography at high and low pH for the analysis of the cytosolic proteome of Corynebacterium glutamicum. The proteome coverage achieved by this approach, 55%, is the highest reported up to day for this bacterium. A total of 1644 proteins including single-peptide based identifications were identified. The sample was also analysed by other conventional methods in the proteome analysis. The classical 2D-PAGE approach presents more limitations and delivered 166 different proteins including enzymes of the main metabolic pathways. Complementary results were found at peptide level for the LC-MALDI and 2D-PAGE approaches. Fractions collected during the first dimension at high pH were analysed by LC-MALDI MS and compared with the analysis carried out by LC-ESI-IT MS, which identified 745 proteins [1]. Further comparison with results found in literature confirmed that the two-dimensional reversed phase combination with LC-MALDI MS/MS is a promising tool in the proteome analysis. The MALDI based approach showed higher sensitivity than other approaches and was able to identify proteins over a larger dynamic range, based on the codon adaptation indexes of the proteins.

An die Large-Scale Proteomanalyse von komplexen biologischen Mischungen sind eine Reihe von Anforderungen gestellt. Unter Anderem sind Trennungen mit hohem Auflösungsvermögen, High-Throughput Massenspektrometrie, präzise Massenbestimmung und Bioinformatik-Tools erforderlich. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Evaluierung der Kombination aus LC-MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie mit einer zwei-dimensionalen Trennung basierend auf Reverse-Phase-Chromatographie bei hohen und niedrigen pH-Werten. Des cytosolischen Proteoms von Corynebacterium glutamicum wurde mit der Methode analysiert. Dies ermöglichte die Indentifizierung von 55% des Proteoms von Corynebacterium glutamicum und ist damit der nach momentanem Kenntnisstand effizienteste Ansatz. Insgesamt konnten 1644 verschiedene Proteine identifiziert werden. Konventionelle Methoden der Proteomanalyse erreichten deutlich schlechtere Ergebnisse. So erzielte der klassische 2D-PAGE-Ansatz bei deutlich mehr Einschränkungen nur 166 Proteinidentifikationen inklusive wichtiger Enzyme der Stoffwechselwege. Komplementäre Ergebnisse konnten auf der Peptid-Ebene für LC-MALDI und 2D-PAGE Ansätze gefunden werden. Fraktionen der ersten Dimension bei hohem pH-Wert mittels LC-MALDI MS wurden analysiert und mit Ergebnissen aus LC-ESI-IT MS [1] Untersuchungen verglichen. Es hat sich gezeigt, dass der MALDI-basierte Ansatz höhere Sensitivität aufweist und in der Lage war Proteine über eine weitaus größere dynamische Reichweite bezogen auf den Codon Adaptation Index zu identifizieren.