3D magnetic resonance microscopy of dehydrated biological specimens

Abstract

Objectives: The major theme of this thesis is the evaluation of the potential of Magnetic Resonance Microscopy (MRM) for branches of the life sciences that have previously seen few or no applications of this non-invasive methodology, particularly for cell biology, palaeontology and cryobiotechnology. An emphasis will be put on the role of liquid water whose multiple biological functions — as a solvent, structural element and metabolite — render it essential for life as we know it. Background: Dehydration beyond a critical threshold poses a serious threat to most organisms in their active state, and mechanisms helping to cope with draught stress present an evolutionary advantage in environments lacking permanent access to liquid water. From a biotechnological point of view, mastering the reversible transition between hydrated and dehydrated states of biological material would allow their long-term storage and facilitate a continuous supply, especially in cases where cell and tissue culture are impossible or not desirable. One of the ways to achieve this is cryopreservation, an arsenal of methods designed to store biological materials for long terms at biologically low temperatures to minimise degradation. In recent years, a trend has developed towards freezing of small cell clusters or even single cells, as opposed to large chunks of tissue. This creates an increased demand for miniaturised cryopreservation systems, and the reduced amount of material raises the need for high-resolution non-invasive supervision of the cryoprocessing. Method: Magnetic Resonance (MR) techniques have become famous precisely for their non-invasiveness and their sensitivity to liquid water, yet microscopic MR applications to dehydrated samples have been scarce, mainly because (i) the signal-to-noise ratio decreases upon dehydration — even dramatically so upon freezing — and (ii) high spatial resolutions translate into a considerable reduction of the already low signal intensity. The primary goals of this study were, therefore, to determine whether these two major barriers can be overcome individually as well as in combination and to evaluate whether the strong magnetic fields necessary for such experiments could interfer with cellular physiology. Results: Microscopic MR image series allowed the non-invasive assessment of the morphology within a well-hydrated cell biological model system (oocytes and embryos of the frog Xenopus laevis), in extreme examples of long-term preservation and dehydration (fossil remains of invertebrate, vertebrate and plant species) and in cryobiological samples ranging from tumor cell spheroids to larvae of cold-hardy insects. Cell division and embryogenesis could be observed in MRM images of Xenopus embryos, and spatially localised MR spectra from subcellular compartments delivered biochemical information about Xenopus oocytes in their normal state and upon uptake of an externally applied drug. A previously described apparent magnetic field effect on Xenopus embryos could be shown not to depend on the magnetic field, as opposed to a new effect found in oocytes artificially deprived of their jelly coat. MRM data allowed the diagnosis of pathological alterations in fossils and the monitoring of cryoprotectant effects in frozen or supercooled insects. Conclusions: These experiments demonstrate that, from a technical perspective,MRM indeed has the potential to become a tool for cell biology, palaeontology as well as cryobiotechnology and that side effects of the methodology, though detectable under unphysiological conditions, do not prevent that.

Zielsetzung: Hauptthema dieser Dissertation ist die Auslotung der Analysemöglichkeiten, welche die Magnetresonanzmikroskopie (MRM) in Bereichen der Lebenswissenschaften bietet, die bisher keine oder wenige Anwendungen dieser nicht-invasiven Methodik erfahren haben, insbesondere Zellbiologie, Paläontologie und Kryobiotechnologie. Ein Schwerpunkt wird auf die Rolle flüssigen Wassers gelegt, das aufgrund seiner vielfältigen biologischen Funktionen — als Lösungsmittel, Struktur- und Stoffwechselelement — eine der wichtigsten Grundvoraussetzungen für Leben darstellt. Hintergrund: Dehydrierung über ein bestimmtes Maß hinaus birgt für die aktiven Stadien der meisten Organismen eine ernste Gefahr. Demzufolge stellen Mechanismen zur Bewältigung von Wassermangel einen deutlichen evolutionären Vorteil in einer Umgebung dar, wo permanenter Zugang zu flüssigem Wasser fehlt. Aus biotechnologischer Sicht ist die Beherrschung eines reversiblen Überganges biologischer Materialien vom hydrierten in den dehydrierten Zustand von Interesse, würde dies doch deren Langzeitaufbewahrung und eine prinzipiell permanente Verfügbarkeit ermöglichen, besonders in Fällen, in denen Zell- und Gewebekultur unmöglich oder nicht erwünscht sind. Dieses Ziel kann auf unterschiedlichen Wegen erreicht werden. Einer davon ist die Kryokonservierung — ein Arsenal von Methoden, welche darauf abzielen, biologisches Material langfristig bei biologisch tiefen Temperaturen zu lagern, wodurch Stoffwechselprozesse sehr stark verlangsamt werden oder ganz zum Erliegen kommen. Gegenwärtig gibt es einen Trend weg vom Einfrieren großer Gewebestücke und hin zu kleinen Zellhaufen oder sogar einzelnen Zellen. Damit einher geht eine zunehmende Nachfrage nach miniaturisierten Kryokonservierungssystemen, und der verringerte Umfang einzelner Gefrierproben verlangt zudem nach einer hochauflösenden und zunehmend nicht-invasiven Überwachung der Kryoprozessierung. Methode: Kernspin- bzw. Magnetresonanztechniken (MR) verdanken ihre Popularität vor allem ihrer nicht-invasiven Natur und ihrer Empfindlichkeit gegenüber flüssigem Wasser, jedoch blieben mikroskopische Anwendungen dieser Technik an dehydrierten Proben bisher rar. Die Hauptgründe dafür sind, dass (i) das Signal-Rausch-Verhältnis mit der Dehydrierung abnimmt — beim Gefrieren sogar dramatisch — und (ii) die geforderte hohe räumliche Auflösung eine beträchtlichen Verringerung der ohnehin geringen Signalintensität bedeutet. Das erste Ziel der vorliegenden Studie war daher festzustellen, ob diese zwei grundlegenden Hindernisse zunächst einzeln, aber auch in Kombination überwunden werden können und abzuschätzen, inwiefern die starken magnetischen Felder, die für solche Experimente nötig sind, die zelluläre Physiologie beeinflussen könnten. Ergebnisse: Anhand mikroskopischer MR-Bildreihen konnte die interne Morphologie eines wasserreichen zell- und entwicklungsbiologischen Modellsystems (Oozyten und Embryos des Frosches Xenopus laevis) nicht-invasiv bestimmt werden. Dies gelang ebenso in extrem langzeitkonservierten wasserarmen Proben (Fossilien vonWirbellosen,Wirbeltieren und Pflanzen) wie in kryobiologischen Systemen, die von Tumorzell-Sphäroiden bis zu Larven kälteresistenter Insekten reichten. Zellteilung und Embryogenese konnten mit MRM-Bildserien sich entwickelnder Xenopus-Embryonen verfolgt werden, und ortsspezifische MR-Spektren von subzellulären Kompartimenten lieferten biochemische Informationen über Xenopus-Oozyten unter physiologischen Bedingungen sowie nach Verabreichung einer pharmakologischen Testsubstanz. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass ein zuvor beschriebener scheinbarer Magnetfeldeffekt auf Xenopus-Embryonen ganz unabhängig vom Magnetfeld auftritt und vielmehr auf die künstliche Entfernung der Gallerthülle, welche Amphibien-Eier umgibt, zurückzuführen ist, während in unbefruchteten Eizellen — ohne Gallerthülle — tatsächlich eine magnetfeldinduzierte Pigmentverschiebung beobachtet werden kann. Des Weiteren lieferten MRM-Daten pathologische Befunde aus dem Inneren intakter Fossilien und umfassende Einsichten in Gefrierschutzmechanismen gefrorener sowie unterkühlter Insektenlarven. Schlussfolgerungen: Diese Experimente zeigen, dass MRM vielfältig als analytische, diagnostische oder Prozesskontrolltechnik in Zellbiologie, Paläontologie und Kryobiotechnologie angewendet werden kann und dass nachweisbare, jedoch nur unter nichtphysiologischen Bedingungen auftretende methodenbedingte Nebenwirkungen dem nicht im Wege stehen.