SciDok

Eingang zum Volltext in SciDok

Lizenz

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-24345
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2009/2434/


Untersuchungen zum intrazellulären Transportweg und der in vivo Toxizität von Ricin A (RTA) in Hefe

Intracellular trafficking and in vivo toxicity of Ricin A chain (RTA) in yeast

Schnöder, Tina

pdf-Format:
Dokument 1.pdf (3.748 KB)

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us
SWD-Schlagwörter: Translokation , Saccharomyces cerevisiae , Degradation , Ricin
Freie Schlagwörter (Deutsch): ERAD , Ubiquitinierung , A/B-Toxin
Freie Schlagwörter (Englisch): ERAD , ubiquitination , A/B toxin
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schmitt, Manfred J. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.09.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 13.10.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Das Pflanzentoxin Ricin aus Ricinus communis gehört zur Gruppe der A/B-Toxine, die aus einer katalytischen A-Kette und einer oder mehreren B-Ketten aufgebaut sind. Das Toxin gelangt über die Bindung der B-Kette an Galaktose-haltige Strukturen auf der Zelloberfläche endozytotisch in die Zielzelle und wird in einem retrograden Prozess bis zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) transportiert. Bislang wird angenommen, dass der eigentliche ER/Cytosol-Export von RTA unter Ausnutzung der ER-assoziierten Degradation (ERAD) erfolgt. Im Cytosol fungiert die katalytische A-Kette als RNA N-Glykosidase und depuriniert ribosomale RNA, was eine Hemmung der Proteinbiosynthese und letztendlich die Apoptose der Zelle bewirkt.
Anhand der intrazellulären Expression verschiedener cytotoxischer RTA-Derivate im ER-Lumen von Hefezellen wurde der molekulare Retrotranslokations-Mechanismus der Ricin A Kette näher untersucht. Durch die Analyse ausgewählter Hefe-Deletionsmutanten konnten zelluläre Komponenten identifiziert werden, die in diesem Prozess sowie für die in vivo Toxizität von RTA eine entscheidende Rolle spielen.
Die Expression der beiden ER-luminalen RTA-Varianten K1- bzw. K28-RTA induzierte ein vermindertes Wachstum der transformierten Wildtyp-Hefen, während die in vivo Expression der mutierten RTA-Derivate K1- bzw. K28-RTAE177D einen resistenten Phänotyp verursachte. Die in vivo Expression der Konstrukte K1-/K28-RTA konnte mittels radioaktiven "Labeling"-Experimenten gezeigt werden, im Gegensatz zu der ER-luminalen Toxin-Variante Kar2-RTA konnte jedoch der Nachweis einer posttranslationalen RTA-Glykosylierung im ER nicht erbracht werden, was einen Hinweis auf einen zumindest deutlich eingeschränkten Import von Ricin A in das ER lieferte.
Für beide Konstrukte konnte ein Eintritt in das Endoplasmatische Retikulum indirekt durch die verminderte in vivo Toxizität in Mutanten mit Defekten im posttranslationalen ER-Import, im Signalpeptidase-Komplex sowie in cytosolischen Chaperon-Mutanten bewiesen werden. Das Protein L12 der ribosomalen GTPase-Domäne spielte eine essentielle Rolle für die in vivo Toxizität von Ricin A.
Ein Transport des Toxins über den Golgi-Apparat schien für dessen in vivo Toxizität nicht ausschlaggebend zu sein. Im Gegensatz zur ER-luminalen Variante Kar2-RTA nutzen die Konstrukte K1-/K28-RTA sowohl Komponenten des Hrd1-Komplexes (ERAD-L), als auch des Doa10-Komplexes (ERAD-C). Die Abwesenheit klassischer ERAD-Komponenten wie Hrd1p, Hrd3p, Der1p, Usa1p, Ubx2p, Ubc7p, Cue1p, Ubc1p, Doa10p und/oder Cne1p führte zu einem drastischen Aktivitätsverlust von RTA. Eine Beteiligung des Cdc48-Komplexes konnte ebenfalls durch indirekte Hinweise bestätigt werden.
Die Polyubiquitinierung scheint eine entscheidende Funktion für die in vivo Toxizität und die Retrotranslokation von RTA einzunehmen. Wurde die Polyubiquitinierung der Konstrukte K1-/K28-RTA durch Austausch der internen Lysinreste oder durch Überexpression einer mutierten Ubiquitin-Form, die keine Polyubiquitin-Ketten mehr ausbilden kann, verhindert, so kam es zu einer deutlich verminderten Toxizität. Eine in vivo Interaktion von RTA mit Ubiquitin konnte mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementation (BiFC) nachgewiesen werden.
Es konnte zudem eine "Screening"-Methode etabliert werden, mit der es möglich ist, eine Vielzahl von Hefe-"Knock-out"-Mutanten effektiv und in relativ kurzer Zeit auf Sensitivität gegen RTA zu untersuchen, und somit weitere Komponenten zu identifizieren, die am intrazellulären Transport und der in vivo Toxizität von RTA beteiligt sind.
Kurzfassung auf Englisch: The plant toxin ricin from Ricinus communis is a family member of so-called A/B toxin in which a catalytic A subunit is associated with one or more cell-binding B subunits. After binding of the B subunit to galactose-containing cell surface receptors, the holotoxin is taken up by endocytosis and delivered to the endoplasmic reticulum via retrograde transport through the Golgi. For ER-to-cytosol dislocation the toxin probably exploits components of the ER-associated degradation machinery (ERAD). Within the cytosol the A subunit acts as RNA N-glykosidase that depurinates ribosomal RNA inducing inhibition of protein synthesis and apoptosis.
In this study, intracellular expression of different ER luminal RTA variants has been used to characterize toxin retrotranslocation from the ER into the cytosol of intoxicated yeast cells. Selected yeast deletion mutants were screened for toxin sensitivity in order to identify cellular components crucial for the in vivo toxicity of ricin A.
In vivo functionality of the different RTA constructs was tested by in vivo toxicity assays. Thus it could be demonstrated that chimeric toxin variants with wildtype RTA are significantly more toxic for yeast cells than variants containing mutated RTAE177D. In vivo expression of each RTAE177D variant was demonstrated by [35S] labelling experiments. In contrast to the ER luminal variant Kar2-RTA, posttranslational glycosylation of K1- and/or K28-RTA was not detectable, indicating failing or inefficient ER import when driven by either K1 or K28 signal sequence.
Entry of K1-/K28-RTA into the yeast ER lumen could be verified by a significant decrease in toxicity after in vivo expression in mutants either defective in posttranslational ER import, in signal peptidase complex components and/or in cytosolic chaperones.
For both RTA constructs access to the Golgi was not essential for toxin dislocation and/or in vivo toxicity. In contrast to the ER luminal variant Kar2-RTA, the toxin variants K1-/K28-RTA both required components of the Hrd1- and Doa10-complex for retrotranslocation. Lack of classical ERAD components such as Hrd1p, Hrd3p, Der1p, Usa1p, Ubx2p, Ubc7p, Cue1p, Ubc1p, Doa10p and/or Cne1p as well as Cdc48 complex components was accompanied by a complete loss in RTA toxicity.
Polyubiquitination of RTA was shown to be essential for both in vivo toxicity and retrotranslocation. Preventing polyubiquitination of RTA either by substitution of all internal lysine residues or by simultaneous overexpression of mutant ubiquitin (Ub-RR48/63), unable to form polyubiquitin chains, resulted in a significant decrease in the in vivo toxicity of ricin A.
To identify new components involved in RTA toxicity and/or intracellular transport, a genetic screen based on GFP fluorescence was established which allows comprehensive identification and analysis of S. cerevisiae knock-out mutants defective in ER-to-cytosol retrotranslocation of RTA.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

Home | Impressum | Über SciDok | Policy | Kontakt | Datenschutzerklärung | English