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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-36793
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2011/3679/


In vivo Topologie und Lokalisation des zellulären HDEL-Rezeptors Erd2p und dessen Funktion bei der Endozytose desviralen K28-Toxins in Hefe

In vivo topology and localization of the cellular HDEL receptor Erd2p and its function for endocytosis of the viral K28 toxin in yeast

Dausend, Julia

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SWD-Schlagwörter: Endocytose , Rezeptor , Bäckerhefe , Topologie
Freie Schlagwörter (Deutsch): AB-Toxin , retrograder Transport
Freie Schlagwörter (Englisch): AB toxin , retrograde transport
Institut: Fachrichtung 8.3 - Biowissenschaften
Fakultät: Fakultät 8 - Naturwissenschaftlich-Technische Fakultät III
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schmitt, Manfred J. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.03.2011
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 29.03.2011
Kurzfassung auf Deutsch: K28, ein viral kodiertes A/B-Toxin von Killerstämmen der Hefe Saccharomyces cerevisiae tötet sensitive Zielzellen durch Inhibierung der DNA-Synthese, Arretierung des Zellzyklus und Induktion der Apoptose. Die Aufnahme erfolgt in einem zweistufigen, rezeptorvermittelten Prozess über die Zellwand und die Plasmamembran. Das Toxin durchläuft den Sekretionsweg retrograd und wird Heterodimer in das Zytosol disloziert. Die α-Untereinheit entfaltet im Nukleus ihre Toxizität, während die β-Untereinheit ubiquitiniert und proteasomal abgebaut wird. Die Schlüsselrolle im retrograden Transport von K28 nimmt der HDEL-Rezeptor Erd2p ein. Frühere Experimente deuteten auf eine Funktion von Erd2p als Sekundärrezeptor des Toxins auf Ebene der Plasmamembran hin. In der vorliegenden Arbeit wurde der HDEL-Rezeptor der Hefe S. cerevisiae auf seine zelluläre Lokalisation, Struktur und Funktion untersucht, um den Mechanismus der Erd2p-vermittelten Endozytose von K28 aufzuklären. Die Lokalisation von Erd2p wurde mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning- Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Als zweites Nachweissystem wurde ein nach dem "RAS recruitment"-System modifizierter, wachstumsbasierter Plasmamembran-Lokalisationsreporter zur Anwendung gebracht. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse eine Kolokalisation von Erd2p in ER- und Golgi-Kompartimenten sowie in der Plasmamembran. Zur Topologie-Analyse von Erd2p wurde eine in silico Vorhersage mit drei in vivo Topologie-Reportern kombiniert. Die Fusionsproteine aus verkürzten Erd2p-Varianten mit dem C-terminalen Wachstumsreporter RAS für die zytosolische Orientierung, mit dem Glykosylierungsreporter SUC2AV5 für die luminale Orientierung und mit dem wechselseitigen, redoxsensitiven Reporter ro2GFP bestätigten eine Nin - Cin-Topologie von Erd2p mit sechs Transmembranhelices. Über Mutagenese wurden Erd2p-Rezeptor-Varianten ohne potentielle Endozytosemotive hergestellt. Diese Varianten waren in der Lage, den Verlust der chromosomalen ERD2-Kopie funktionell zu komplementieren. Die Deletion des N-terminalen NPF-Signals in Erd2p führte zu einem Sensitivitätsverlust gegen K28 und weist auf eine untergeordnete Funktion in der Endozytose der Erd2p/K28-Komplexe hin. Aus dem Ersetzen aller vier Lysinreste innerhalb des zytosolischen C-terminalen Lysin-Clusters geht ein funktioneller Erd2p-Rezeptor hervor, der jedoch nicht mehr in der Lage ist, eine endozytotische K28-Aufnahme zu vermitteln. Im Zusammenhang mit der Bestätigung der Erd2p/Rsp5p- Interaktion in der BiFC-Analyse belegen diese Ergebnisse die Notwendigkeit einer signalgebenden Ubiquitinierung von Erd2p für die Endozytose von K28. Art-Proteine können die Aufgabe von Adaptern zwischen der Ubiquitin-Ligase Rsp5p und ihren Substraten an der Plasmamembran übernehmen. Die verminderte Sensitivität von Δart2, Δart8 und Δart9-Mutanten gegen K28 liefert einen Hinweis, dass die Interaktion von Erd2p und Rsp5p über die redundanten Art-Proteine vermittelt wird.
Kurzfassung auf Englisch: K28, a viral A/B toxin produced by killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae, kills sensitive yeast cells by inhibition of DNA-synthesis, cell cycle arrest and induction of apoptosis. Cell entry is performed by a two-step receptor-mediated process across the cell wall and the plasma membrane. After retrograde transport through the secretory pathway the toxin dislocates into the cytosol. The α subunit enters the nucleus and displays its toxicity whereas the β subunit is ubiquitinated and proteasomaly degraded. The key component for the retrograde transport of K28 is the HDEL receptor Erd2p. Previous experiments indicated a function for Erd2p as secondary receptor of the toxin at the level of the plasma membrane. In this study the S. cerevisiae HDEL receptor Erd2p was analyzed in terms of cellular localization, structure and function in order to elucidate the mechanism of the Erd2p conducted endocytic uptake of K28. The localization of Erd2p was analyzed in vivo by means of confocal laser scanning fluorescence microscopy. As a second detection system, a growth based plasma membrane localization reporter modified from the RAS recruitment system was applied. Together the results confirmed a colocalization of Erd2p in ER and Golgi compartments as well as in the plasma membrane. The topogical analysis of Erd2p combined in silico prediction and three in vivo topology reporters. Fusion proteins of truncated Erd2p variants with the C-terminal growth reporter RAS for cytosolic orientation, the glycosylation reporter SUC2AV5 for luminal orientation and the ambilateral redoxsensitive reporter ro2GFP verified an Nin - Cin topology of Erd2p with six transmembrane helices. Mutational analysis of Erd2p resulted in several receptor variants avoid of potential endocytotic motifs but still capable to complement an otherwise lethal loss of the chromosomal ERD2 copy. Deletion of the N-terminal NPF signal in Erd2p resulted in a significant decrease in K28 sensitivity indicating a subsidiary function in the endocytosis of Erd2p/K28 complexes. Substitution of all four lysine residues within the cytosolic C-terminal lysine cluster of Erd2p resulted in a functional ER retention receptor yet unable to conduct the endocytosis of K28. Taken together with the confirmation of the Erd2p/Rsp5p interaction via BiFC, those results demonstrate the necessity of a ubiquitinylation process for the Erd2p mediated endocytosis of K28. Art proteins can carry out the task of adaptors between the ubiquitin ligase Rsp5p and its substrates at the plasma membrane. Due to the fact that deletion mutants for ART2, ART8 or ART9 turned out to be less sensitive to K28, the interaction of the endocytic toxin receptor Erd2p and Rsp5p is likely to be mediated by redundant Art proteins.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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