Bestimmung physiologischer Parameter auf Einzelzellebene mit elektrochemischen Messmethoden

Abstract

Genaue Kenntnisse über (patho-)physiologischer Vorgänge auf Einzelzellebene sind eine Grundvoraussetzung, um ein vertieftes Verständnis über die Grundlagen intra- und interzellulärer metabolischer Prozesse zu erlangen. Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) spielt dabei eine wichtige Rolle. In niedrigen Konzentrationen ist es ein Botenstoff, der viele verschiedene zelluläre Prozesse über eine gezielte Oxidation wichtiger Schaltstellen beeinflussen kann. Solche Redox-regulierte Prozesse sind unter anderem Transkription, Biosynthese, Modifikation und der Transport von Proteinen, Apoptose und die Zellalterung. Auch für interzelluläre Kommunikation ist H 2 O 2 relevant, z. B. bei der Migration von Immunzellen zu den Zielorten. In hohen Konzentrationen spielt H 2 O 2 unter anderem als bakterizide Substanz bei der primären Immunantwort eine Rolle. Da H 2 O 2 in vielen metabolischen Prozessen und z. B. auch bei der Zellatmung in den Mitochondrien entstehen kann, ist eine effiziente Regulation der H 2 O 2 -Produktion und –Eliminierung („H 2 O 2 -Homöostase“) durch einzelne Zellen essentiell. Verschiedene Methoden zur Messung von H 2 O 2 werden bereits genutzt, z. B. fluoreszenzbasierte Methoden. Jedoch bietet keine dieser Methoden die Möglichkeit, H 2 O 2 auf Einzelzellebene zu quantifizieren sowie die Dynamik der H 2 O 2 –Produktion und –Eliminierung darzustellen. Elektrochemische H 2 O 2 -Messungen mit Platin-Ultramikroelektroden ermöglichen dies; sie zeichnen sich durch Spezifität, hohe Sensitivität, sowie exzellente zeitliche und räumliche Auflösung aus. Ein Hauptziel dieser Arbeit war es, elektrochemische H 2 O 2 -Messungen sowie deren Quantifizierung an lebenden Einzelzellen zu etablieren, charakterisieren und mögliche Anwendungen zu demonstrieren. Dazu wurde ein Herstellungsverfahren für Platin- Ultramikroelektroden etabliert, welche für diese Messungen eine grundlegende Voraussetzung sind. Mit elektrochemischen Methoden konnte die Menge an H 2 O 2 quantifiziert werden, die ein einzelner, primärer humaner Monozyt produziert, sowie ein vom Monozyten ausgehender H 2 O 2 -Gradient. Da H 2 O 2 sowohl intra-, als auch extrazellulär produziert werden und über die Zellmembran transportiert werden kann, wurde ein Verfahren entwickelt, um extrazelluläre, elektrochemische Messungen mit intrazellulären, Fluoreszenzmikroskopie-Messungen für H 2 O 2 zu kombinieren. Mit diesem Verfahren konnte gezeigt werden, dass extrazelluläres H 2 O 2 von der Zelle aufgenommen wird, intrazellulär produziertes H 2 O 2 die Zelle aber nicht verlässt. Kombinierten Messungen zeigten außerdem, dass eine genetische Veränderung von Mäusen durch dauerhafte Expression des H 2 O 2 -Sensors roGFP2-orp1 die H 2 O 2 -Homöostase ihrer Monozyten beeinflusst. Ein weiteres Ziel war es, mit elektrochemischen Methoden den relativen Sauerstoffverbrauch von lebenden Einzelzellen zu bestimmen. Der O 2 -Verbrauch einer Zelle ermöglicht Rückschlüsse auf Zell-Viabilität, den metabolischen Zustand sowie Reaktionen der Zelle auf Behandlungen mit unterschiedlichen Substanzen. An HEK-293-Zellen konnte gezeigt werden, dass die extrazelluläre Gabe von Coenzym Q10 (einem in der Elektronentransportkette relevanten Coenzym), bzw. hydroxyliertem OH-Coenzym Q10 den O 2 -Verbrauch verringert, also die Atmung hemmt. Zusammengefasst wurden im Rahmen dieser Arbeit elektrochemischen Methoden vorgestellt, die geeignet sind physiologische Parameter, wie die Atmung und die H 2 O 2 -Homöostase an lebenden Einzelzellen nicht-invasiv, spezifisch und in Echtzeit zu messen.

Precise knowledge of (patho-)physiological events on a single-cell level is a prerequisite to obtain deeper insights into the fundamentals of intra- and intercellular metabolism. Hydrogen peroxide (H2O2) plays a key role in many metabolic processes. In low concentrations it is a signaling molecule and influences various cellular processes via precise oxidation of target molecules. Redox-regulated processes are, amongst many others, transcription, biosynthesis, modification and transport of proteins, apoptosis and cell-ageing. H2O2 is also involved in inter-cellular communication, e.g. in regulating migration of immune cells to their target locations. At the same time, H2O2 in high concentrations plays a role for example as a bactericidal substance during the primary immune response. As H2O2 is produced during many metabolic processes, as well as for example during cellular respiration in mitochondria, a well-balanced regulation of its production and elimination (“H2O2-homeostasis”) is essential for cells. Several methods to detect H2O2 are regularly used, such as fluorescence based methods. None of those are suitable to quantify H2O2 on a single-cell level nor can they measure the dynamics of H2O2-production and –elimination. Electrochemical measurements with platinum-ultramicroelectrodes facilitate that, they are characterized by specificity, high sensitivity, as well as outstanding temporal and spatial resolution. One main aim of this work was to establish, characterize and demonstrate electrochemical H2O2-measurements on a single-cell level as well as their quantification. For this purpose a fabrication protocol for platinum-ultramicroelectrodes was established, which are a prerequisite for those electrochemical measurements. Using electrochemical methods, the amount of H2O2 produced by a single primary human monocyte could be quantified, as well as a H2O2-gradient originating from it. As H2O2 can be produced intra- as well as extracellularly and can cross the cell membrane, a procedure was established to combine extracellular, electrochemical measurements of H2O2 with intracellular, fluorescence microscopy determination of H2O2. Using this method, it could be shown that although extracellular H2O2 gets absorbed by the cell, intracellularly produced H2O2 does not leave the cell. Combined measurements also showed that genetic modification of a mouse with the H2O2-sensor roGFP2-orp1 has an influence on the H2O2–homeostasis of its monocytes. Another aim was to electrochemically measure the relative oxygen consumption of single living cells. O2-consumption allows drawing conclusions about cell viability and metabolic state as well as its responses to specific treatments with different substances. Treating HEK-293 cells extracellularly with coenzyme Q10 (a component of the electron transport chain), or with hydroxylated OH-coenzyme Q10 reduced their O2-consumption, thus inhibiting their respiration. Summarized, within the scope of this work electrochemical methods to measure physiological parameters, such as respiration and H2O2-homeostasis, of single living cells non-invasively, specific and in real time were presented.