Einfluss der mitochondrialen Membranarchitektur auf die mitochondriale Calcium-Homöostase

Abstract

Mitochondrien sind Zellorganellen, die über eine komplexe Membranarchitektur verfügen. Sie bestehen aus einer äußeren sowie einer inneren Membran, wobei die innere Membran über zahlreiche Einstülpungen, den sogenannten Cristae, verfügt. Maßgeblich an der Erhaltung dieser Membraneinstülpungen ist der MICOS-Komplex mit seinen Kernuntereinheiten MIC10 und MIC 60 beteiligt. Das eine gestörte Architektur der mitochondrialen Innenmembran Auswirkung auf die oxidative Phosphorylierung sowie auf den Proteinimport haben kann, konnte bereits gezeigt werden. Unklar ist allerdings, ob sich die gestörte Membranarchitektur auch auf Signalwege auswirkt. Ein prominentes Beispiel hierfür ist der second messenger Calcium. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Rolle der hochgradig organisierten Innenmembran von Mitochondrien bei der mitochondrialen Calciumhomöostase zukommt. Bereits etablierte Methoden zur Detektion des mitochondrialen Calciumflusses beziehen sich vor allem auf den zellulären Kontext und verwenden hierbei oft chemische Farbstoffe zur Generierung eines calciumabhängigen Fluoreszenzsignals. Derzeit etablierte Methoden mit isolierten Mitochondrien basieren hingegen meist auf der Zugabe eines fluoreszenz-basierten Sensors in die Puffer-Lösung und detektieren so die Calciumaufnahme von Mitochondrien indirekt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur Detektion des Calciumtransports in isolierten Mitochondrien mit einem genetisch codierten, in der mitochondrialen Matrix lokalisierten, Calciumsensor etabliert. Dies ermöglicht, im Gegensatz zu verbreiteten Methoden mit isolierten Mitochondrien, die direkte Detektion des Anstiegs der Calciumkonzentration in der mitochondrialen Matrix. Die Calciumaufnahme wird durch den Mitochondrialen Calcium Uniporter, kurz MCU, vermittelt. Durch das Calciumtransport Assay können Defekte innerhalb des mitochondrialen Calciumtransports direkt an isolierten Mitochondrien beurteilt werden und somit Defekte an Ort und Stelle detektiert werden. Anhand verschiedener Knockout-Zelllinien, welche eine gestörte Membranarchitektur aufweisen, wurde deren Calciumaufnahme mittels diesem Calciumtransport Assay untersucht. Es zeigten sich hierbei Defekte in der Calciumaufnahme in den Knockout-Zelllinien der MICOS-Kernuntereinheiten MIC10 und MIC60. Sie sind maßgeblich an der Formierung von Crista Junctions beteiligt und erhalten so die Architektur der inneren Membran. Auch in Mitochondrien aus der DNAJC11 und Tafazzin Knockout-Zelllinie, für die Defekte der Membranarchitektur beschrieben wurden, konnte eine verminderte Calciumaufnahme gezeigt werden. In der Tafazzin Knockout-Zelllinie zeigte sich zudem ein verändertes Migrationsverhalten des MCU-Komplexes, was möglicherweise ebenfalls zu dem beobachteten Phänotyp beiträgt. Eine im Vergleich Zusammenfassung 10 zu HEK293T Zellen normale Calciumaufnahme konnte in der Knockout Zelllinie des MICOS-Interaktionspartners CCDC127 beobachtet werden. Diese weist eine unauffällige Membranarchitektur auf. Anzunehmen ist, dass eine intakte Membranarchitektur eine entscheidende Rolle für die mitochondriale Calciumaufnahme besitzt. Eine gestörte Funktion der untersuchten Proteine ist bei neurodegenerativen als auch kardiologischen Erkrankungen beschrieben worden. Hier könnte eine defizitäre Calciumaufnahme pathophysiologische Relevanz besitzen. Ziel dieser Arbeit ist es somit, die Auswirkung einer gestörten mitochondrialen Membranarchitektur auf die mitochondriale Calciumhomöostase zu studieren.

Mitochondria are organelles with a complex membrane architecture. They consist of an outer and an inner membrane. The inner membrane has multiple invaginations, the so-called cristae. MICOS is a protein complex, which is crucial for the maintenance of cristae and therefore for the mitochondrial architecture. The core components of MICOS are Mic 10 and MIC 60. It is well known, that a disturbed mitochondrial architecture affects the oxidative phosphorylation and protein import. However, the effect of a disturbed architecture on cellular signaling are currently unknown. A very prominent member of cellular signaling is the second messenger calcium. This thesis addresses the relevance of a highly organized inner mitochondrial membrane for the mitochondrial calcium homeostasis. Established methods for mitochondrial calcium measurements are focusing on the hole cell and are usually based on chemical sensors that detect a calcium-depended fluorescent signal. Currently established methods for measurements in isolated mitochondria are mainly using extramitochondrial chemical sensors and thereby only indirectly detect the mitochondrial calcium uptake. In this work, I established a novel method for the detection of calcium in isolated mitochondria with a genetically encoded calcium sensor, localized in the mitochondrial matrix. This provides an insight into calcium signals directly derived from the mitochondria. The corresponding calcium transport is mediated by the mitochondrial calcium uniporter MCU. Based on knockout cell lines, which show a disturbed inner mitochondrial membrane architecture, the calcium uptake was analyzed by the calcium transport assay. The knockouts of the MICOS complex core subunits, MIC10 and MIC60, displayed a defective calcium transport. These are relevant for the formation of crista junctions and the maintenance of the inner membrane architecture. Mitochondria of DNAJC11- and Tafazzin cell line, which also display a disturbed inner mitochondrial membrane architecture, also showed a defective calcium uptake. In mitochondria from Tafazzin knockout cell line, the MCU complex additionally is conspicuous, which may also contribute to the reduced calcium uptake. Compared to mitochondria from HEK293T cells, mitochondria from the knockout cell line of the MICOS interactor CCDC127 displayed a regular calcium uptake. These have an inconspicuous membrane architecture. Accordingly, the inner mitochondrial membrane architecture seems to be essential for the mitochondrial calcium homeostasis. A disturbed function of the analyzed proteins is described in neurodegenerative and cardiac diseases. In these cases, a defective mitochondrial calcium uptake could potentially have pathological relevance. Thus, the main goal of this thesis was to focus on the relevance of mitochondrial membrane architecture in relation to the mitochondrial calcium homeostasis.