Polarisation von T-Zellen

Abstract

Körperzellen unterscheiden sich trotz nahezu identischer Gene oft dramatisch in ihrer Morphologie und Funktion. Die unterschiedliche Ausdifferenzierung dieser Zellen kommt durch unterschiedliche Expressionsmuster spezifischer Proteine zustande. Aber für die Funktion vieler Proteine haben deren Lokalisation und die Morphologie der Zelle eine sehr große Relevanz. So exprimieren beispielsweise sowohl die adhärente Epithel-Zelllinie HeLa als auch T-Zellen die am sogenannten “Speicher-vermittelten Kalziumeinstrom“ (SOCE) beteiligten Proteine Orai und STIM. Ebenfalls ist in den Mitochondrien beider Zelltypen der „mitochondriale Kalzium-Uniporter“ (MCU) vorhanden. Dennoch zeigen Experimente in HeLa-Zellen einen geringen Einfluss der Mitochondrien als Kalziumpuffer an der Plasmamembran beim Speicher-vermittelten Kalziumeinstrom, im starken Gegensatz zu Experimenten mit T-Zellen. Die Polarisation der T-Zelle, durch Zellformänderungen und Umverteilungen von Organellen und Proteinen, ist höchst dynamisch im Gegensatz zur Polarisation von HeLa-Zellen. So kommt es beispielsweise bei der Ausbildung einer sogenannten Immunologischen Synapse (IS) zwischen T-Zellen und deren Zielzellen neben der Relokalisation des Zentrosoms zur Kontaktstelle zu starken Formveränderungen der T-Zellen und der Ausbildung von spezifischen Protein-Mustern an der IS. Im Fall von zytotoxischen T-Zellen (stimulierte CD8+) führt dies neben der Aktivierung der T-Zelle zur Abtötung der Zielzelle durch die Fusion zytotoxischer Vesikel mit der Membran der IS. Der Transport dieser Vesikel geschieht laut der etablierten Literatur zunächst als Minus-End-Transport über Mikrotubuli zum Zentrosom, welches die Vesikel anschließend durch den eigenen Kontakt mit der Plasmamembran zur IS transportiert. Dieses Modell steht allerdings im starken Widerspruch zu zahlreichen Veröffentlichungen, die vom Zentrosom unabhängige Mechanismen zur Akkumulation zytotoxischer Vesikel an der IS nachgewiesen haben. Im ersten experimentellen Teil dieser Arbeit wird die adhärente humane Zelllinie HeLa in Form, Volumen und Organellverteilung mit drei verschiedenen T-Zell-Populationen verglichen. Neben der Charakterisierung von T-Zell-Formänderungen zum Deckglas und in das umgebende Kulturmedium werden Bestandteile des Zytoskeletts und die wichtigsten Zellorganellen in allen Zelltypen auf Morphologie und Lokalisation untersucht. Der Einfluss mitochondrialer Fission auf deren Lokalisation wird in Jurkat T-Zellen bestimmt. In stimulierten CD8+ T-Zellen wird die Ausstreckungsgeschwindigkeit in das umgebende Kulturmedium, die Migrationsgeschwindigkeit auf Deckgläsern und die Geschwindigkeit von zytotoxischen Vesikeln und endozytierten CD3-enthaltenden Vesikeln gemessen. Zudem wird das Zellvolumen sowie das individuelle Zellkern- und Mitochondrien-Volumen aller Zelltypen in der Interphase und während der Mitose miteinander verglichen. Im zweiten experimentellen Teil dieser Arbeit werden Zellformänderungen und die Lokalisation von Zytoskelett, Organellen und Signalproteinen in primären stimulierten CD8+ und Jurkat CD4+ T-Zellen bei Superantigen-induziertem Kontakt mit Zellen der humanen B-Zelllinie Raji untersucht. Der genaue Ablauf der IS-Ausbildung, mit und ohne T-Zell-Formänderung in die Migrationsform, ist mit Abständen zur IS und auftretenden Geschwindigkeiten aufgeschlüsselt. Durch eine starke Bindung der Zellen an die verwendeten Deckgläser kommt es zu einer verzögerten und unvollständigen IS-Ausbildung, was die Separation ansonsten zeitgleich stattfindender Prozesse ermöglicht. Neben dem Zentrosom als primärem Zellpol, der innerhalb von Minuten nach Kontakt in die Nähe der IS bewegt wird, werden weitere Zellpole mit Organell- und Protein-Akkumulationen am Uropod und dem Zellkern identifiziert, die in späteren Phasen der IS-Ausbildung in die Nähe der IS gebracht werden. Ebenso werden T-Zellen mit mehr als einem B-Zell-Kontakt untersucht. Das Auftreten von apoptotischen Membranbläschen („Blebs“) in Raji B-Zellen bei Kontakt mit stimulierten CD8+ T-Zellen wird gemessen und zeitlich mit der Zentrosomposition abgeglichen. Bei einem Anteil von Erstkontakten und allen Zweitkontakten traten apoptotische Signale auf, bevor das Zentrosom die IS erreichte. Die bis zu zwanzigfach höher gemessene Geschwindigkeit einzelner Vesikel im Vergleich zum Zentrosom machen eine vom Zentrosom unabhängige Vesikel-Akkumulation an mehreren Zielzell-Kontakten innerhalb kürzester Zeit möglich. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit starke morphologische Unterschiede zwischen HeLa- und T-Zellen, die einige funktionale Vergleiche zwischen beiden Zelltypen in Frage stellen. Weiterhin unterstützen die erarbeiteten Ergebnisse eine Vielzahl anderer Studien, die eine vom Zentrosom unabhängige Akkumulation zytotoxischer Vesikel an der IS nachgewiesen haben, im Widerspruch zum etablierten Modell. Mithilfe aller in dieser Arbeit generierten Ergebnisse und im Abgleich mit der Literatur wird ein Modell für die gesamte T-Zell-Polarisation vorgeschlagen. Die in dieser Arbeit erstellten umfangreichen Volumen-, Bewegungs-, Abstands- und Geschwindigkeitsdaten tragen zur Verbesserung von Computer-Modellen der T-Zell-Polarisation bei, durch die Vorhersagen zum Verhalten der T-Zellen im menschlichen Körper getroffen werden können.

Despite almost identical genes, somatic cells often differ dramatically in their morphology and function. The various differentiation of these cells is due to different expression patterns of specific proteins. However, for the function of many proteins, their localization and the morphology of the cell are highly relevant. For example, both the adherent epithelial cell line HeLa and T cells express the proteins Orai and STIM, which are essential for the so-called “store-operated-calcium-entry” (SOCE). Likewise, the mitochondrial-calcium-uniporter (MCU) is present in the mitochondria of both cell types. Nevertheless, experiments with HeLa cells show a negligible influence of mitochondria as calcium buffers at the plasma membrane during SOCE, in stark contrast to experiments with T cells. The polarization of T cells, by changes in cell shape and redistributions of organelles and proteins, is highly dynamic in contrast to the polarization of HeLa cells. For example, during the formation of a so-called Immunological Synapse (IS) between T cells and their target cells, in addition to the movement of their centrosome to the contact area, T cells undergo strong shape changes and form specific protein patterns at the IS. In case of cytotoxic T cells (stimulated CD8+), additionally to the activation of the T cell, the formation of an IS leads to the killing of the target cell by the fusion of cytotoxic vesicles with the plasma membrane of the IS. According to established literature, the transport of these vesicles initially occurs as minus-end transport over microtubules to the centrosome, which subsequently delivers the vesicles to the IS by its own contact with the plasma membrane. However, this model is in strong disagreement to numerous publications that have demonstrated centrosome independent mechanisms of cytotoxic vesicle accumulation at the IS. The first experimental part of this study compares the adherent human cell line HeLa in terms of shape, volume, and organelle distribution with three different T cell populations. In addition to characterizing T cell shape changes onto the coverslip and into the surrounding culture medium, components of the cytoskeleton and the most important cell organelles are examined in all cell types for morphology and localization. The influence of mitochondrial fission on their localization is studied in Jurkat T cells. For stimulated CD8+ T cells, the extension speed into the surrounding culture medium, the migration speed on coverslips and the speed of cytotoxic vesicles and endocytosed CD3-containing vesicles is measured. Furthermore, the whole cell volume as well as the individual cell nucleus and mitochondria volumes are compared for all utilized cell types in the interphase and during mitosis. The second experimental part of this study examines changes in the cell shape and the localization of cytoskeleton, organelles and signaling proteins in primary stimulated CD8+ and Jurkat CD4+ T cells during superantigen-induced contact with the human B cell line Raji. The exact process of IS formation, with and without T cell shape changes into the migratory form, is detailed with distances to the IS and occurring velocities. A strong binding of cells to the utilized glass substrate leads to a delayed and incomplete IS formation, enabling the separation of otherwise concurrent processes. In addition to the centrosome as a cell pole, which is moved close to the IS within minutes after contact, other cell poles with organelle and protein accumulations are identified at the uropod and the nucleus, which are brought close to the IS during later stages of IS formation. Furthermore, T cells with more than one B cell contact are examined accordingly. The occurrence of apoptotic membrane “blebs” in Raji B cells upon contact with stimulated CD8+ T cells is measured and correlated with the position of the centrosome. Apoptotic signals occurred in a proportion of first contacts and all subsequent contacts before the centrosome reached the IS. The up to twentyfold higher measured velocities of individual vesicles compared to the centrosome make a centrosome-independent accumulation of vesicles at multiple target cell contact sites within a short time possible. In short summary, the results of this study show strong morphological differences between HeLa and T cells that question some functional comparisons between the two cell types. Furthermore, the results support a variety of other studies which have demonstrated a centrosome-independent accumulation of cytotoxic vesicles at the IS, in disagreement with the established model. Based on all results obtained in this study and in accordance with current literature, a model for the entire T cell polarization is proposed. The extensive volume, movement, distance, and velocity data generated in this study can be used to improve computer models of the T cell polarization, which could be able to predict the behavior of T cells in the human body.