Expressions- und Replikationsanalyse in differenzierenden menschlichen Stammzellen

Abstract

Es ist bekannt, dass Genamplifikationen, d.h. zusätzliche Kopien eines bestimmten Gens oder einer Genomregion, in Krebszellen vorkommen und mit einer schlechteren Prognose assoziiert sind, wahrscheinlich weil sie die Resistenz gegen Chemotherapeutika fördern. In den letzten Jahren wurden sie auch in menschlichen Stammzellen beschrieben. Der Mechanismus oder die Mechanismen, durch die sie entstehen, sind jedoch noch nicht geklärt, obwohl verschiedene Modelle vorgeschlagen wurden, einschließlich der Re-Replikation. Unter Re-Replikation versteht man einen Replikationsfehler, der durch die Lizenzierung und nachfolgende Aktivierung eines Replikationsursprungs nach seiner initialen Aktivierung gekennzeichnet ist. Bisherige Studien zur Erstellung von Zellprofilen haben in der Regel Stammzellen verwendet, die schon einen Tag oder einige Tage lang differenziert wurden, so dass eine erhebliche Lücke im Verständnis der molekularen Ereignisse in den entscheidenden frühen Stunden der Differenzierung besteht. In dieser Arbeit wird untersucht, ob während der frühen Differenzierung menschlicher Stammzellen eine Re-Replikation stattfindet, und es werden die Profile von microRNAs (miRNAs) und der messengerRNAs (mRNAs) untersucht, da miRNAs, kleine nicht-kodierende RNAs, bekanntermaßen eine Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen spielen. Um dieses Forschungsziel zu erreichen, wurden zeitaufgelöste Ansätze verwendet, um dynamische Veränderungen während des Differenzierungsprozesses in fünf Differenzierungsexperimenten zu erfassen: spontane Differenzierung von menschlichen neuralen Stammzellen und menschlichen Skelettmyoblasten sowie von menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die Adipogenese, Chondrogenese und Osteogenese durchlaufen. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Analyse von miRNA- und mRNA-Expressionsprofilen mittels Microarray-Technologie, gefolgt von einer bioinformatischen Analyse, zur Klärung ihrer funktionellen Auswirkungen. Im zweiten Teil wurde die molekulare Kombination in Verbindung mit dem Einbau von Thymidin-Analoga verwendet, um das Auftreten von Re-Replikationsereignissen zu untersuchen. Diese Arbeit lieferte drei Schlüsselergebnisse: die Beteiligung der hsa-miR-29-Familie und die Korrelation zwischen miRNAs und Genen in der frühen Stammzelldifferenzierung sowie das Auftreten von Replikationsereignissen in differenzierenden menschlichen Skelettmyoblasten und menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die eine Chondrogenese durchlaufen. Die hsa-miR-29-Familie, bestehend aus vier miRNAs, befand sich bei allen Differenzierungsexperimenten konsistent unter den 10 am stärksten herunterregulierten miRNAs und war überwiegend in Clustern organisiert. Die Targets dieser miRNAs waren in spezifischen Clustern angereichert, von denen viele eine erhöhte Expression aufwiesen. Insbesondere die mit dem Zellzyklus und der Differenzierung in Verbindung stehenden Wege waren über allen Differenzierungsexperimenten angereichert. Es wurden starke Korrelationen zwischen spezifischen miRNA-Clustern und Genclustern in jedem Differenzierungsexperiment beobachtet, wobei die Schwerpunktlinien dieser Cluster oft spiegelbildliche Muster aufwiesen. Es wurde bereits beschrieben, dass Mitglieder der hsa-miR-29-Familie bestimmte Differenzierungsprozesse beeinflussen, obwohl ihre genaue Rolle und der Regulationsmechanismus noch unklar sind. In spontan differenzierenden Skelettmyoblasten wurden Re-Replikationsereignisse zwischen den Zeitpunkten 2 h und 6 h beobachtet, während davor und danach keine derartigen Ereignisse auftraten, was auf einen spezifischen Zeitrahmen für die Re-Replikation hinweist. In proliferierenden menschlichen Skelettmyoblasten wurden keine Re-Replikationsereignisse beobachtet. Re-Replikationsereignisse wurden auch in differenzierenden und proliferierenden menschlichen mesenchymalen Stammzellen, die eine Chondrogenese durchlaufen, zu allen drei untersuchten Zeitpunkten (0 h, 4 h, 6 h) beobachtet. Re-Replikation könnte in gesunden menschlichen Stammzellen häufiger auftreten als bisher angenommen, insbesondere während der Differenzierung, was Bedenken hinsichtlich der Genomstabilität in induzierten pluripotenten Stammzellen und anderen Stammzellen, die für Stammzelltherapien verwendet werden, aufwerfen könnte. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, die Mechanismen der Entstehung von Genamplifikationen zu erforschen. Diese Ergebnisse liefern Einblicke in die neuartige miRNA-vermittelte Regulation und das Auftreten von Replikation während der anfänglichen Stammzelldifferenzierung und werfen wichtige Fragen zu ihrer Rolle bei der Bestimmung des Zellschicksals und der Genomstabilität auf. Die weitere Entschlüsselung des Zusammenspiels zwischen Replikation und Stammzelldifferenzierung wird für die Entwicklung sicherer und wirksamer Stammzelltherapien von entscheidender Bedeutung sein.

Gene amplifications, or additional copies of a specific gene or genomic region, are known to occur in cancer cells and to be linked to worse prognosis, probably by aiding them to resist chemotherapeutic agents. In the last few years, they have also been described in human stem cells. However, the mechanism(s) by which they arise have not been yet elucidated, although different models, including re-replication, have been proposed. Re-replication refers to a replication error characterized by the licensing and subsequent firing of an origin of replication after its initial activation. Previous profiling studies usually used stem cells that were differentiating for at least one or a few days, leaving a significant gap in understanding the molecular events occurring during the crucial early hours of differentiation. This thesis investigates the possibility of re-replication happening during the early differentiation of human stem cells, as well as their microRNA (miRNA) and messenger RNA (mRNA) profiles since miRNAs, small non-coding RNAs, are known to play a role in stem cell differentiation. To address this research objective, time-resolved approaches were used to capture dynamic changes throughout the differentiation process, in five distinct differentiation assays: spontaneous differentiation of human neural stem cells and human skeletal myoblasts, as well as human mesenchymal stem cells undergoing adipogenesis, chondrogenesis, and osteogenesis. The first aspect of this thesis involved the analysis of miRNA and mRNA expression profiles using microarray technology, followed by bioinformatic analysis to elucidate their functional implications. In the second part, molecular combing in conjunction with thymidine analog incorporation was used to investigate the occurrence of re-replication events in human mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis and in human skeletal myoblasts. This work yielded three key results: Firstly, it revealed the involvement of the hsa-miR-29 family during early stem cell differentiation. Secondly, it highlighted the correlations and pathway significance of miRNAs and genes in early stem cell differentiation. Lastly, it uncovered the occurrence of re-replication events in differentiating human skeletal myoblasts and human mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis. The hsa-miR-29 family, consisting of four miRNAs, was consistently among the top 10 downregulated miRNAs across all differentiation assays and predominantly clustered together. The targets of these miRNAs were enriched in specific clusters, many of which showed increased expression. In particular, pathways related to cell cycle and differentiation were enriched across all differentiation assays. Strong correlations were observed between specific miRNA clusters and gene clusters in each differentiation assay, with the centroid lines of these clusters often displaying mirroring patterns. Members of the hsa-miR-29 family have already been described to influence certain differentiation processes, although their exact role and mechanism of regulation are still unclear. In spontaneously differentiating skeletal myoblasts, re-replication events were observed between the 2 h and 6 h time points while no such events were observed before or after, indicating a defined timeframe for re-replication. No re-replication events were observed in proliferating human skeletal myoblasts. Re-replication events were also observed in differentiating and proliferating human mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis at all three time points studied (0 h, 4 h, 6 h). Re-replication may be more common than previously thought in healthy human stem cells, particularly during differentiation, which may raise concerns about genome stability in induced pluripotent stem cells and other stem cells used for stem cell therapies. This highlights the need to elucidate the mechanisms of gene amplification formation. These findings elucidate novel miRNA-mediated regulation and occurrences of re-replication during initial stem cell differentiation, raising important questions about their roles in cell fate determination and genome stability. Further unraveling the interplay between re-replication and stem cell differentiation will be essential for developing safe and effective stem cell therapies.