Synthesis of coenzyme Q10 derivatives, their structural and electrochemical characterization, and functional studies on cellular metabolism

Abstract

Quinones and their reduced forms, the hydroquinones, represent a large and vital class of redox-active biomolecules. Among these substances p-benzoquinones (p-BQ) are one of the most attention-grabbing group of molecules playing pivotal roles in numerous cellular processes. Coenzymes Q (Qs) are derivatives of p-BQs containing two neighbouring methoxy groups, a methyl group, and a sidechain whose length is species-dependent. Qs are present in the majority of aerobic organisms with coenzyme Q10 (Q10) being the predominant variant in humans. A plethora of physiological roles have been ascribed to Q10 starting from its primary and widely recognized function as an electron and proton carrier within the mitochondrial respiratory chain up to its role as an antioxidant and regulator of the cellular redox homeostasis. However, the considerable amounts of Q10 found in non-mitochondrial membranes suggest additional cellular functions. Our group has identified a new class of Qs which are specifically modified at position 2- or 3- of the p-BQ ring by replacement of the corresponding methoxy group with a hydroxyl group to give mono-hydroxylated forms of Qs (HO-Qs). It has been suggested that HO-Qs have stronger antioxidant activity and improved abilities to transport Ca2+ across artificial bio-membranes than their corresponding Qs. The high hydrophobicity of Q10 and its low solubility in numerous solvents impose a major limitation in studying Q10. Therefore, less hydrophobic but still active derivatives of Q10, coenzyme Q1 (Q1) and decylubiquinone (dUQ), were utilised here to explore the physico-chemical as well as biological properties of Qs with a particular focus on the HO-Qs. The main goal of this study was to investigate the interactions between HO-Qs and Qs with Ca2+, and to analyse their (patho-)physiological relevance in terms of a potential impact on cellular and mitochondrial functions. Since HO-Q1 and HO-dUQ are commercially not available methods for their synthesis were developed. Structural characterization of the newly synthesized products by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy was performed. It was observed that the synthesis consistently yielded a mixture of two constitutional isomers, modified either at position 2- or 3- of the quinone ring, i.e., 2-HO-Q and/or 3-HO-Q. The physico-chemical and redox properties of the newly produced HO-Q1 and HO-dUQ as well as of Q1 and dUQ were investigated by voltammetric techniques. Various conditions including aqueous (buffered and unbuffered) media, organic protic and aprotic solvents were applied to obtain insights into the redox behaviour of HO-Qs and Qs within biological membranes. For instance, in the inner mitochondrial membrane Q10 encounters a strong gradient transitioning from a non-aqueous (aprotic) environment within the membrane to increasingly protic conditions toward the membrane surface and ultimately to the fully aqueous environment in the mitochondrial matrix or intermembrane space. The redox processes of Qs and HO-Qs could proceed either as a simultaneous transfer of 2e− in a single step or as a sequential transfer of 1e− at a time, in two separate steps. The outcome depended on factors like solvent type, the presence or absence of protons, the availability of hydrogen bond donors or the presence of metal ions. In addition, voltammetric studies were conducted to unravel the interactions between Ca2+ and Qs or HO-Qs. The data revealed the formation of ion pairs with several stoichiometries, not only between HO-Qs and Ca2+ but also between the Qs and Ca2+. Moreover, HO-Qs showed enhanced antioxidant properties and higher affinity for interaction with Ca2+ when compared to the corresponding Qs. Biologically important was the finding that HO-Qs are present as monoanions at neutral pH, i.e., the −OH group at ring position 2 or 3 tends to deprotonate. Finally, the potential physiological relevance of HO-Q1 and HO-dUQ was assessed. At this point, additional related compounds such as mitoquinone (mQ), its hydroxylated form (HO-mQ), Q10 and HO-Q10 were included in the comparative studies. As the efficiency of cell treatment with Q10 and HO-Q10 is greatly hampered by their insolubility in aqueous media, water-soluble formulations of Q10 and HO-Q10 were prepared and used for applications to biological samples. Prior to the functional studies, the intracellular concentrations of Q10 and HO-Q10 in HEK-293 cells were determined before and after supplementation of the cells with water-soluble formulations of Q10 and HO-Q10. Since Q10 is the predominant form of Qs in human cells, a certain amount of Q10 was detected in the untreated HEK-293 cells. In contrast, HO-Q10 was not detected in the untreated controls. HPLC data conducted 30 minutes after supplementation of the cells with the corresponding compounds showed significantly elevated contents of Q10 and HO-Q10 indicating that the compounds efficiently passed through the plasma membrane and were accumulated in the cells. Assessing the toxicity of exogenously applied Qs and HO-Qs significant alterations in cell viability after treatment with mQ and to a lesser extent with HO-mQ were revealed. Additionally, mQ and HO-mQ substantially affected mitochondrial membrane potential, mitochondrial bioenergetics, and cellular Ca2+ homeostasis, strongly indicating cytotoxic effects. Mitochondrial respiration was evaluated measuring O2 consumption of isolated murine heart mitochondria using a Clark-type electrode. Notably, all HO-Qs hindered mitochondrial respiration. On the contrary, Qs showed diverse impacts, either by stimulating (Q1 and dUQ) or inhibiting (Q10, only in the presence of Ca2+) the respiration. The most striking result was that only HO-Q10 and Q10 showed Ca2+-dependent inhibitions of the respiration, whereas the other HO-Qs inhibited respiration independently of the presence of Ca2+. However, no alterations in cytosolic Ca2+ levels following treatment of HEK-293 cells with Q10 and HO-Q10 were observed. Immediately after application of HO-dUQ, a gradual increase in the cytosolic Ca2+ levels of HEK-293 cells was observed which was caused by Ca2+ release from the intracellular Ca2+ stores, presumably from mitochondria. In conclusion, Q10-like compounds such as Q1, dUQ, mQ and their hydroxylated derivatives albeit having similar redox properties showed different biological activities compared to Q10. Their variable functions in living cells and isolated mitochondria clearly indicated that they cannot substitute for each other probably due to different interactions to relevant membrane and protein components, hence caution should be taken when designating them as analogues of Q10.

Chinone und ihre reduzierten Formen, die Hydrochinone, stellen eine große und wichtige Klasse von redoxaktiven Biomolekülen dar. Unter diesen Substanzen sind die p Benzochinone ( p BQ) eine der interessantesten Molekülgruppen, die bei zahlreichen zellulären Prozessen eine wichtige Rolle spielen. Die Coenzyme Q (Qs) sind Derivate von p BQs, die zwei benachbarte Methoxygruppen, eine Methylgruppe und eine Seitenkette enthalten, deren Länge von der Spezies abhängt. Die Qs sind in den meisten aeroben Organismen vorhanden, wo bei Coenzym Q 10 (Q 10 ) beim Menschen die Hauptvariante ist. Dem Q 10 wird eine Vielzahl physiologischer Funktionen zugeschrieben, von seiner primären und weithin anerkannten Funktion als Elektronen und Protonenüberträger innerhalb der mitochondrialen Atmungskette bis zu seiner Rolle als Antioxidans und Reg ulator der zellulären Redox Homöostase. D ie beträchtlichen Mengen an Q 10 , die in nicht mitochondrialen Membranen gefunden wurden, suggerieren allerdings zusätzliche zelluläre Funktio nen. Unsere Gruppe hat eine neue Klasse von Qs identifiziert, die spezifisch an Position 2 oder 3 des p BQ Rings modifiziert sind, indem die entsprechende Methoxygruppe durch eine Hydroxylgruppe substituiert wird, um monohydroxylierte Formen von Qs (HO Qs) zu erhalten. Den HO Qs werden ver besser t e Eigenschaften zugeschrieben als den entsprechenden Qs, z. B. eine stärkere antioxidative Aktivität und die Fähigkeit , um Ca 2+ durch artifizielle Biomembranen zu transportieren. Die ausgeprägte Hydrophobizität von Q 10 und seine geringe Löslichkeit in zahlreichen Lösungsmitteln stellen eine große Einschränkung bei der Untersuchung von Q 10 dar. Daher wurden hier Coenzym Q 1 (Q 1 ) und Decylubiquinon (dUQ) als weniger hydrophobe aber immer noch aktive Q 10 Derivate verwendet, um die physikalisch chemischen und biologischen Eigenschaften von Qs mit besonderem Fokus auf den HO Qs zu untersuchen. Das Hauptziel dieser Studie bestand darin, die Interaktionen zwischen HO Qs und Qs mit Ca 2+ zu untersuchen und folglich ihre (patho --)physiologische Relevanz im Hinblick auf mögliche Auswirkungen auf zelluläre und mitochondriale Funktionen auf zu klären . Da HO Q 1 und HO dUQ kommerziell nicht erhältlich sind, wurden Methoden für ihre Synthese entwickelt. Die neu synthetisierten Produkte wurden mittels Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie strukturell charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass die Synthese konsistent ein Gemisch aus zwei konstitutionellen Isomeren ergeben hat, die entweder an der Position 2 oder 3 des Chinonrings modifiziert waren, d.h. 2 HO Q und/oder 3 HO Q. Die physikalisch chemischen und redoxspezifischen Eigenschaften der neu hergestellten HO Q 1 und HO dUQ sowie von Q 1 und dUQ wurden mit voltammetrischen Techniken untersucht. Verschiedene Bedingungen, darunter wässrige (gepufferte und ungepufferte) Lösungen, organische protische und aprotische Lösungsmittel wurden angewandt, um Einblicke in das Redoxverhalten von HO Qs und Qs in biologischen Membranen zu erhalten. Beispielweise trifft Q 10 in der inneren Mitochondrienmembran auf einen Gradienten von Bedingung en, der von eine m nichtwässrigen (aprotischen) Umfeld innerhalb der Membran zu mehr protischen Bedingungen an der Membranoberfläche und schließlich zu einer vollständig wässrigen Um gebung in der Mitochondrienmatrix oder im Intermembranraum wechselt. Die Redoxprozesse von Qs und HO Qs können entweder als gleichzeitiger Transfer von 2 e in einem einzigen Schritt oder als sequentieller Transfer von jeweils 1 e in zwei getrennten Schritten ablaufen. D er Verlauf war abhängig von Faktoren wie der Art des Lösungsmittels, der An oder Abwesenheit von Protonen, der Verfügbarkeit von Wasserstoffbrückendon oren oder der Anwesenheit von metallische n Ionen. Voltammetrische Untersuchungen haben da zu beigetragen, die Interaktionen zwischen Ca 2+ und Qs oder HO Qs zu entschlüsseln. Die Daten zeigten die Bildung von Ionenpaaren mit verschiedenen Stöchiometrien, nicht nur zwischen HO Qs und Ca 2+2+, sondern auch zwischen den Qs und Ca 2+2+. Außerdem zeigten die HO Qs im Vergleich zu den entsprechenden Qs verbesserte antioxidative Eigenschaften und eine höhere Affinität zur Interaktion mit Ca 2+2+. Biologisch wichtig war die Feststellung, dass HO Qs bei neutralem pH Wert als Monoanionen existieren, d. h. die OH G ruppe an Ringposition 2 oder 3 tendiert zur Deprotonierung. Schließlich wurde die potenzielle physiologische Bedeutung von HO Q 1 und HO dUQ bewertet. An diesem P unkt wurden weitere verwandte Substanzen wie Mitochinon (mQ), seine hydroxylierte Form (HO mQ), Q 10 und HO Q 10 in vergleichende Studien einbezogen. Da die Effizienz der Zellbehandlung mit Q 10 und HO Q 10 durch ihre Unlöslichkeit in wässrigen Lösungen stark eingeschränkt ist, wurden wasserlösliche Formulierungen von Q 10 und HO Q 10 hergestellt und auf biologische Proben ange wendet . Im Vorfeld zu den Funktionsstudien wurden die intrazellulären Konzentrationen von Q 10 und HO Q 10 in HEK 293 Zelllysaten unter physiologischen Bedingungen und nach Behandlung der Zellen mit Q 10 und HO Q 10 gemessen . Nachdem die Zellen für 30 Minuten den Substanzen exponiert waren, zeigten die HPLC Daten einen dreifachen Anstieg der Q 10 Menge im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen . Obwohl HO Q 10 unter physiologischen Bedingungen nicht gefunden werden konnte, war es nach seiner Anwendung deutlich im Zellhomogenat vorhanden Bei der Evaluierung der Toxizität von exogen applizierten Qs und HO Qs wurden signifikante Veränderungen der Zellproliferation nur nach der Behandlung mit mQ und in geringerem Ausmaß mit HO mQ gefunden. Weiterhin zeigten die Daten, dass mQ und HO mQ das mitochondriale Membranpotenzial, die mitochondriale Bioenergetik und die zelluläre Ca 2+ Homöostase erheblich beeinflussten, was stark auf zytotoxische Wirkungen hinweist. Die mitochondriale Respiration wurde durch Messung des O 2 Verbrauchs isolierter Mitochondrien des Mäuseherzens mit Hilfe einer Clark Elektrode evaluiert. Bemerkenswert ist, dass alle HO Qs die mitochondriale Res p iration inhibierten. Im Gegensatz dazu zeigten die Qs unterschiedliche Effekte, indem sie die Respiration entweder stimulierten (Q 1 und dUQ) oder inhibierten (Q 10 , nur in Anwesenheit von Ca 2+2+). Das auffälligste Ergebnis war, dass nur HO Q 10 und Q 10 eine Ca 2+ abhängige Inhibierung der Respiration zei gten, während die anderen HO Qs die Respiration unabhängig von der Anwesenheit von Ca 2+ inhibierten. Es wurden jedoch keine Veränderungen des zytosolischen Ca 2+ Niveaus nach der Behandlung von HEK 293 Zellen mit Q 10 und HO Q 10 beobachtet. Gleich nach der Applikation von HO dUQ wurde ein gradueller Anstieg des zytosolischen Ca 2+ Niveaus in HEK 293 Zellen beobachtet, der nachweislich auf die Freisetzung von Ca 2+ aus den intrazellulären Ca 2+ Speichern, vermutlich aus den Mitochondrien, zurückzuführen ist. Zusammenfass end kann festgestellt werden, dass Q 10 ähnliche Substanzen, obwohl sie ähnliche Redox Eigenschaften haben, unterschiedliche biologische Aktivitäten im Vergleich zu Q 10 zeigen. Die elektrochemischen Eigenschaften von Qs und HO Qs sowie ihre unterschiedlichen Funktionen in lebenden Zellen und isolierten Mitochondrien wiesen eindeutig darauf hin, dass sie einander nicht ersetzen können und dass bei ihrer Benennung als Anal oga von Q 10 Vorsicht geboten ist.