Mutual regulation of transcriptomes between alveolar epithelial cells and fibroblasts during alveolar regeneration and pulmonary fibrosis

Abstract

Lung epithelial progenitor/stem cells play an important role in pulmonary homeostasis and regeneration. A disturbed crosstalk between fibroblasts and epithelial cells contributes to the loss of lung structure in chronic lung diseases, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and idiopathic pulmonary fibrosis (IPF). It is therefore important to understand how fibroblasts and lung epithelial cells interact with each other during regeneration and disease progression. DKK3, secreted by renal tubular epithelial cells, is closely associated with renal fibrosis. Single-cell data indicate that both airway epithelial cells and (alveolar) fibroblasts express DKK3 in the lungs. However, the role of DKK3 in pulmonary fibrosis is unclear. The aim of this work was to establish suitable in vitro culture models to study the interaction between fibroblasts and pneumocytes in regeneration and pathological states. Additionally, the function of DKK3 in lung regeneration and disease states was investigated using an air liquid interface culture (ALI) model and a mouse model for pulmonary fibrosis. Alveolar type 2 cells (AT2) derived from human lungs were differentiated in Matrigel to alveolar organoids which showed a grape-like structure consisting of AT2 cells. Co-culturing with fibroblasts isolated from human lung tissue of different donors during the differentiation phase resulted in a secretory, cystic phenotype of the organoids. Single-cell analysis, histology, and qRT-PCR revealed that such cystic organoids show reduced expression of surfactant protein C (SFTPC) but increased expression of Mucin 5B (MUC5B). There was no expression of the airway epithelial markers keratin 5 (KRT5) and secretoglobin family 1A member 1 (SCGB1A1). Single-cell transcriptomics further showed that the patient-derived fibroblasts co-cultured with pneumocytes were highly activated as seen in murine lung fibrosis models and in IPF patients. Bleomycin treatment further increased the expression of MUC5B, fibrosis markers (e.g. CTHRC1, ACTA2) and DKK3 in organoids co-cultured with fibroblasts. ALI cultures were established with lung epithelial cells and fibroblasts isolated from murine lung tissue. For this purpose, the lung epithelial cells were seeded apically on the filter membrane and the fibroblasts in the basolateral compartment. Single-cell transcriptomics showed that co-cultivation with fibroblasts led to increased expression of AT2 markers in pneumocytes and club cell populations and trans-differentiation of club cells towards pneumocytes. This maintenance of AT2 cells was likely mediated through activation of regulons, such as the Etv5 regulon. The co-culture with fibroblasts led to an increased transepithelial barrier. Conversely, lung epithelial cells induced increased expression of IL-6 and other differentiation factors (e.g. FGFs) in fibroblasts, mediated by activation of signalling pathways (e.g. JAK-STAT3, NF-κB) and the Cebpb regulon. Stimulation with low concentrations of recombinant IL-6 enhanced epithelial barrier formation and expression of AT2 and club cell markers. Lung epithelial cells and fibroblasts isolated from Dkk3 knockout- and wildtype-mice were cultured in the ALI model and 24-well plate, respectively. Single-cell transcriptomics showed that Dkk3 was expressed in basal cells and fibroblasts. Epithetical cells isolated from Dkk3-/- mice developed a significantly reduced transepithelial electrical resistance (TEER). qRT-PCR showed a reduced expression of pneumocyte markers (e.g. Sftpc, Hopx and Aqp5) in Dkk3-/- cultures. The single-cell data showed that the proportion of pneumocytes (AT2, AT1 and AT1 immature cells) was higher in WT cultures than in Dkk3-/- cultures, while the proportion of airway epithelial cells was increased in knockout cultures. qRT-PCR results showed a decreased expression of Sftpc and increased expression of type 1 markers (e.g. Hopx, Aqp5) in wildtype epithelial cells after 4 days of ALI culture, whereas there was no increase in type 1 markers in knockout epithelial cells after 4 days of ALI culture. DKK3-expressing cells were significantly more abundant in fibrotic lesions of IPF patient and in mice with bleomycin-induced pulmonary fibrosis. The lung damage induced by bleomycin was dramatically decreased in Dkk3 knockout mice, as shown by invasive lung function and fibrosis scores. This work shows that overly activated fibroblasts induce aberrant differentiation of alveolar organoids, as observed in chronic lung disease. Alveolar AT2-derived organoids transdifferentiate into MUC5B+ secretory AT2 cells, which have been described in honeycomb structures in IPF. The obtained results suggest that the interaction between fibroblasts and AT2 cells leads to a vicious cycle in IPF progression. The model can be used to further elucidate the interaction between fibroblasts and AT2 cells in IPF and for drug development. In the ALI co-culture model, regulatory loops were identified that mediate regeneration and differentiation of the alveolar epithelium in a cooperative manner with the mesenchymal compartment. DKK3 expressed by epithelial cells or fibroblasts may have a regulatory role in the differentiation of AT2 cells to AT1 cells during lung regeneration. DKK3 has been shown to have a role in promoting lung fibrosis in the bleomycin-dependent mouse model. Thus, the above results suggest that the interaction between alveolar epithelial cells and fibroblasts is important for regeneration and disease progression.

Progenitor-/Stammzellen des Lungenepithels spielen eine wichtige Rolle bei der Homöostase und Regeneration der Lunge. Eine gestörte Wechselwirkung zwischen Fibroblasten und Epithelzellen trägt zum Verlust der Lungenstruktur bei chronischen Lungenerkrankungen wie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) und der idiopathischen Lungenfibrose (IPF) bei. Daher ist es wichtig zu verstehen, auf welche Weise Fibroblasten und Lungenepithelzellen bei der Regeneration der Lunge und Krankheitsverläufen miteinander interagieren. DKK3, das von renalen Tubulusepithelzellen sezerniert wird, ist eng mit der Nierenfibrose verbunden. Einzelzelldaten deuten darauf hin, dass sowohl Epithelzellen der Atemwege als auch (alveoläre) Fibroblastenzellen in der Lunge DKK3 exprimieren. Die Rolle von DKK3 bei der Lungenfibrose ist jedoch unklar. Ziel dieser Arbeit war es, geeignete in-vitro-Kulturmodelle zu etablieren, um die Interaktion zwischen Fibroblasten und Pneumozyten bei der Regeneration der Lunge und bei pathologischen Zuständen zu untersuchen. Darüber hinaus wurde die Funktion von DKK3 bei der Lungenregeneration und Krankheitszuständen mithilfe von Air Liquid Interface (ALI)-Kulturen und murinen Lungenfibrose-Modellen untersucht. Aus menschlichen Lungen stammende alveoläre Typ-2-Zellen (AT2) wurden in Matrigel zu alveolären Organoiden differenziert, die eine traubenartige Struktur aufwiesen. Während der Differenzierungsphase führte die Co-Kultur mit Fibroblasten, die aus menschlichem Lungengewebe verschiedener Spender isoliert wurden, zu einem sekretorischen, zystischen Phänotyp der Organoide. Einzelzellanalyse, Histologie und qRT-PCR ergaben, dass solche zystischen Organoide eine verminderte Expression des Surfactant-Proteins C (SFTPC), aber eine erhöhte Expression von Mucin 5B (MUC5B) aufwiesen. Es zeigte sich keine Expression für Maker von Atemwegsepithelzellen wie Keratin 5 (KRT5) und Sekretoglobin Familie 1A Mitglied 1(SCGB1A1). Einzelzell-Analysen zeigten außerdem, dass die von Patienten stammenden Fibroblasten, die zusammen mit Pneumozyten kultiviert wurden, stark aktiviert waren, wie es auch in murinen Lungenfibrosemodellen und bei IPF-Patienten der Fall ist. Die Behandlung mit Bleomycin erhöhte die Expression von MUC5B, Fibrosemarkern (z. B. CTHRC1, ACTA2) und DKK3 in Organoiden, die mit Fibroblasten kultiviert wurden. ALI-Kulturen wurden mit aus murinem Lungengewebe isolierten Lungenepithelzellen und Fibroblasten angelegt. Hierfür wurden die Lungenepithelzellen apikal auf der Filtermembran und die Fibroblasten im basolateralem Kompartiment ausgesät. Einzelzell-Analysen zeigten, dass die gemeinsame Kultivierung mit Fibroblasten zu einer erhöhten Expression von AT2-Markern in Pneumozyten und Keulenzellpopulationen sowie zur Transdifferenzierung von Keulenzellen in Richtung Pneumozyten führte. Diese Aufrechterhaltung der AT2-Zellen wurde wahrscheinlich durch die Aktivierung von Regulons wie dem Evt5-Regulon vermittelt. Die Ko-Kultur mit Fibroblasten führte zu einer verstärkten transepithelialen Barriere. Umgekehrt induzierten Lungenepithelzellen eine erhöhte Expression von IL-6 und anderen Differenzierungsfaktoren (z. B. FGFs) in Fibroblasten, was durch die Aktivierung von Signalwegen (z.B. JAK-STAT3, NF-κB) und dem Cebpb-Regulon vermittelt wurde. Die Stimulation mit niedrigen Konzentrationen von rekombinantem IL-6 verstärkte die Bildung der epithelialen Barriere und die Expression von AT2- und Keulenzellmarkern. Lungenepithelzellen und Fibroblasten, aus Dkk3-Knockout- und Wildtyp-Mäusen isoliert, wurden im ALI-Modell bzw. in 24-Well-Platten kultiviert. Einzelzell-Analysen zeigten, dass Dkk3 in Basalzellen und Fibroblasten exprimiert wurde. Epitheliale Lungenzellen, die aus Dkk3-/- Mäusen isoliert wurden, entwickelten einen signifikant reduzierten transepithelialen Widerstand. qRT-PCR-Analysen zeigten eine reduzierte Expression von Pneumozytenmarkern (z.B. Sftpc, Hopx und Aqp5) in Dkk3-/- Kulturen. Einzelzell-Anaylsen zeigten, dass der Anteil der Pneumozyten (AT2, AT1 und AT1 unreife Zellen) in WT-Kulturen höher war als in Dkk3-/--Kulturen, während der Anteil der Epithelzellen der Atemwege in den Knockout-Kulturen erhöht war. Die qRT-PCR-Ergebnisse zeigten eine verringerte Expression von Sftpc und eine erhöhte Expression von Typ-1-Markern (z. B. Hopx, Aqp5) in Wildtyp-Epithelzellen nach 4 Tagen ALI-Kultur, während es in Knockout-Epithelzellen nach 4 Tagen ALI-Kultur keinen Anstieg der Typ-1-Marker gab. DKK3-exprimierende Zellen waren in fibrotischen Läsionen von IPF-Patienten und in Mäusen mit Bleomycin-induzierter Lungenfibrose signifikant erhöht. Die Bleomycin-induzierte Lungenschädigung war bei Dkk3-Knockout-Mäusen drastisch reduziert, was durch invasive Lungenfunktion und Fibrose-Scores belegt wurde. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass aktivierte Fibroblasten eine pathologische Differenzierung von alveolären Organoiden hervorruft, wie sie bei chronischen Lungenerkrankungen beobachtet wird. Die alveolären AT2-abgeleiteten Organoide transdifferenzieren zu MUC5B+ sekretorische AT2-Zellen, wie sie für honeycomb Strukturen bei IPF beschrieben wurden. Die erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Interaktion von Fibroblasten mit AT2-Zellen zu einem Teufelskreis in der IPF-Progression führt. Das Modell kann zur weiteren Aufklärung der Interaktion zwischen Fibroblasten und AT2-Zellen bei IPF und zur Entwicklung von Medikamenten verwendet werden. Im ALI-Kokulturmodell wurden Regelkreise identifiziert, die die Regeneration und Differenzierung des Alveolarepithels in Zusammenspiel mit dem mesenchymalen Kompartiment vermitteln. DKK3, das von Epithelzellen oder Fibroblasten exprimiert wird, könnte eine regulierende Rolle bei der Differenzierung von AT2-Zellen zu AT1-Zellen bei der Lungenregeneration spielen. Es hat sich gezeigt, dass DKK3 eine Rolle bei der Förderung der Lungenfibrose im Bleomycin-abhängigen Mausmodell spielt. Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass die Interaktion zwischen Alveolarepithelzellen und Fibroblasten für die Regeneration und das Fortschreiten der Krankheit wichtig ist.