A novel Splice Variant of Stim1 – Stim1B differentially regulates Store Operated Calcium Entry

Abstract

Calcium (Ca2+) acts as a second messenger orchestrating various intracellular processes. Store-operated calcium entry (SOCE) is known for its role in regulating Ca2+ homeostasis, gene expression, metabolism, cytokine release, and proliferation in immune cells. This mechanism depends on the calcium concentration in the Endoplasmic Reticulum (ER) and the Stim protein family residing in the ER acts as a sensor promptly responding to ER Ca2+ store depletion and facilitates the entry of calcium from extracellular through gating of plasma membrane residing Orai family of proteins. Recent advances have shown that SOCE not only plays a mediator role in immune cells but also in electrically excitable cells such as neurons and skeletal muscle cells. Yet, the intricate mechanisms governing how SOCE adapts to diverse cellular needs, cellular architectural complexities, and metabolic demands remain less clear. Alternative splicing of the STIM family encompassing Stim1 & Stim2 yielded several functionally distinct variants. In this work, a new splice variant of Stim1- Stim1B is identified and characterized. Insertion of Exon B between exon 12 and 14 led to a frameshift and terminated early resulting in a significantly short protein variant lacking 170 amino acids, but incorporates an additional 26 residues encoded by exon B and those translated due to the frameshift. RNA and protein expression studies showed that Stim1B is exclusively expressed in the brain with expression levels surpassing conventional Stim1 in the cerebellum and varying levels of expression in other regions of the brain. Functionally, patch clamp electrophysiology experiments with heterologous overexpression of Stim1B were able to demonstrate that Stim1B is able to activate both murine and human ORAI homologs, albeit with reduced kinetics, ICRAC as well as reduced inactivation and that Domain B, but not the missing C terminal residues of Stim1 or the additional translated residues encoded by Stim1B was responsible for it. Additional patch clamp experiments with mutants identify a specific motif KANR within domain B as the key determinant behind Stim1B‘s unique properties. Immunoprecipitation with self-made antibody against Stim1B indicated that Stim1B exhibited a stronger interaction with Stim2 than Stim1. Immunohistological investigations in wild-type neurons provide insight into Stim1B’s distinct localization. Unlike Stim1, Stim1B is targeted to presynaptic terminals. Functionally, neuronal patch clamp experiments underscore the pivotal role of domain B in modulating synaptic transmission where Stim1B was able to convert classic synaptic depression into short-term synaptic enhancement (STE) at high-frequency stimulation (HFS) which is dependent on Ca2+ and Orai-dependent Ca2+ release. Lastly, behavioral analysis involving mice lacking Stim1B strongly indicated an impairment in motor performance and adaptive cerebellar learning. Overall, the findings from this work broaden our understanding of the mechanism of Ca2+ regulation, highlighting the relevance of STIM1 splicing on neuronal calcium homeostasis and synaptic plasticity, thereby shaping cellular adaptations in response to varying metabolic demands. Most importantly, the observed behavioral impairments in mice lacking Stim1B emphasize the physiological relevance of Stim1B in neurological processes.

Zusammenfassung: Calcium (Ca2+) fungiert als zweiter Botenstoff und orchestriert verschiedene intrazelluläre Prozesse. Die Calciumeintragung über speicherabhängige Mechanismen (Store-operated calcium entry, SOCE) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Ca2+-Homöostase, der Genexpression, dem Stoffwechsel, der Freisetzung von Zytokinen und der Proliferation in Immunzellen. Dieser Mechanismus hängt von der Calciumkonzentration im endoplasmatischen Retikulum (ER) ab, und die Stim-Proteinfamilie im ER fungiert als Sensor, der rasch auf die Erschöpfung des ER-Ca2+-Speichers reagiert und den Eintritt von Calcium aus dem extrazellulären Raum durch die Steuerung von Orai-Proteinen an der Plasmamembran ermöglicht. Neuere Fortschritte haben gezeigt, dass SOCE nicht nur in Immunzellen eine Rolle spielt, sondern auch in elektrisch erregbaren Zellen wie Neuronen und Skelettmuskelzellen. Dennoch bleiben die komplexen Mechanismen, die regeln, wie SOCE sich an verschiedene zelluläre Anforderungen, zelluläre architektonische Komplexitäten und metabolische Anforderungen anpasst, weniger klar. Die alternative Spleißung der STIM-Familie, zu der Stim1 und Stim2 gehören, hat mehrere funktionell unterschiedliche Varianten hervorgebracht. In dieser Arbeit wurde eine neue Spleißvariante von Stim1, Stim1B, identifiziert und charakterisiert. Die Insertion von Exon B zwischen Exon 12 und 14 führte zu einem Rahmenverschiebung und einer vorzeitigen Beendigung, was zu einer erheblich verkürzten Proteinvariante führte, die 170 Aminosäuren fehlt, aber zusätzlich 26 Aminosäuren aus Exon B und aufgrund der Rahmenverschiebung übersetzte Aminosäuren enthält. RNA- und Proteinexpressionsstudien zeigten, dass Stim1B ausschließlich im Gehirn exprimiert wird, wobei die Expression in der Kleinhirnrinde die von herkömmlichem Stim1 übertrifft und in anderen Regionen des Gehirns variierende Expressionsniveaus aufweist. Funktionell konnten Patch-Clamp-Elektrophysiologie-Experimente mit heterologer Überexpression von Stim1B zeigen, dass Stim1B in der Lage ist, sowohl murine als auch humane ORAI-Homologe zu aktivieren, wenn auch mit reduzierter Kinetik, ICRAC und reduzierter Inaktivierung. Dabei war es das Domänen-B, und nicht die fehlenden C-terminale Aminosäuren von Stim1 oder die zusätzlich übersetzten Aminosäuren von Stim1B, das dafür verantwortlich war. Zusätzliche Patch-Clamp-Experimente mit Mutanten identifizierten ein spezifisches Motiv, KANR innerhalb von Domäne B, als das entscheidende Merkmal hinter den einzigartigen Eigenschaften von Stim1B. Immunopräzipitationen mit einem selbst hergestellten Antikörper gegen Stim1B zeigten, dass Stim1B eine stärkere Wechselwirkung mit Stim2 aufwies als mit Stim1. Immunohistologische Untersuchungen an Neuronen in Wildtyp-Mäusen gaben Aufschluss über die besondere Lokalisation von Stim1B. Im Gegensatz zu Stim1 wurde Stim1B an präsynaptischen Enden gezielt. Funktionell unterstrichen neuronale Patch-Clamp-Experimente die wichtige Rolle von Domäne B bei der Modulation der synaptischen Übertragung, wobei Stim1B klassische synaptische Depression in eine kurzfristige synaptische Verstärkung (STE) bei Hochfrequenzstimulation (HFS) umwandeln konnte, was von Ca2+ und Orai-abhängiger Ca2+-Freisetzung abhängig war. Schließlich deuteten Verhaltensanalysen an Mäusen, die Stim1B fehlte, stark auf Beeinträchtigungen in der motorischen Leistung und dem adaptiven Lernen im Kleinhirn hin. Insgesamt erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit unser Verständnis des Mechanismus der Ca2+-Regulation und betonen die Bedeutung des STIM1-Spleißens für die neuronale Calciumhomöostase und die synaptische Plastizität, wodurch zelluläre Anpassungen an unterschiedliche metabolische Anforderungen geformt werden. Am wichtigsten ist jedoch, dass die beobachteten Verhaltensstörungen bei Mäusen ohne Stim1B die physiologische Bedeutung von Stim1B für neurologische Prozesse unterstreichen.