Metabolic engineering of Streptomyces albus for enhanced production of the reverse antibiotic nybomycin

Abstract

Streptomycetes, filamentous bacteria are well-known for their capability of producing bioactive secondary metabolites. With raised antimicrobial resistance of bacteria, these metabolites receive increased attention. Recently, the biosynthetic gene cluster of the reverse antibiotic nybomycin was found and its genes were firstly expressed heterologously in S. albus. The biosynthesis is complex since various building blocks are required. Nybomycin represents a promising antibiotic for the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). In this work, the aim was to improve the heterologous production in S. albus. In a minimal medium with mannitol as carbon source, 0.86 mg L-1 were produced in 275 h. Initial metabolic engineering attempts failed since the promoter PermE* was solely active during growth phase while main production occurred in stationary phase. Fluorescence-based promoter screening reveals the strong constitutive promoter PkasOP* with superior activity in growth and production phase. Multiple rounds of engineering in the pentose phosphate pathway (PPP) and shikimic acid pathway (SAP), to improve the supply of nybomycin building blocks, doubled nybomycin production to 1.6 mg L-1. Gene expression analysis, applying RNA-sequencing, revealed cluster-situated regulators nybWXYZ. Silencing the regulation by deletion of nybWXYZ yielded strain NYB-11, which produced 12 mg L-1 of nybomycin in a substrate optimized minimal medium containing 50 g L-1 mannitol.

Streptomyceten, filamentöse Bakterien sind bekannt für ihre Fähigkeit bioaktive Sekundärmetabolite zu produzieren. Kürzlich wurden die Biosynthese Gene für das reverse Antibiotikum Nybomycin entdeckt und erstmals heterolog in S. albus exprimiert. Die Biosynthese ist komplex, da verschiedene Bausteine verwendet werden. Nybomycin stellt ein vielversprechendes Antibiotikum für die Behandlung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) dar. Das Ziel dieser Arbeit war es, die heterologe Produktion in S. albus zu verbessern. In einem minimalen Wachstumsmedium auf Mannitol, wurden 0.86 mg L-1 in 275h produziert. Erste Versuche der Stammoptimierung scheiterten, da der verwendete Promoter PermE* lediglich in der Wachstumsphase aktiv war, während die Hauptproduktion in der stationären Phase ablief. Durch Fluoreszenz-basierte Promoter Studien, konnte der konstitutive Promoter PkasOP* mit verbesserter Aktivität in Wachstums- und Produktionsphase gefunden werden. Mehrere Runden der Stammoptimierung im Pentose Phosphat Weg und im Shikimat Weg, um die Bereitstellung von Nybomycin Bausteinen zu verbessern, verdoppelten die Nybomycin Produktion auf 1.6 mg L-1. Durch Gen Expressionsanalysen mittels RNA-Sequenzierung wurden die Cluster eigenen Regulatorgene nybWXYZ entdeckt. Das Unterdrücken der Regulation durch Deletion der Gene nybWXYZ in Stamm NYB-11, brachte eine Produktionssteigerung auf 12 mg L-1 Nybomycin in einem Substrat optimierten minimal medium mit 50 g L-1 Mannitol.