Anwendung der MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Diagnostik des Bandwurms Taenia saginata unter Berücksichtigung verschiedener Probenlagerungsbedingungen

Abstract

Einleitung: Humane Infektionen mit dem Schweinebandwurm Taenia saginata können eine intestinale Taeniasis auslösen, die von asymptomatischer Trägerschaft bis zu schwerwiegenden gastrointestinalen Symptomen führen kann. Die Infektion mit T. saginata ist vor allem in Ländern des globalen Südens mit schlechten sanitären Verhältnissen von Bedeutung. Die Diagnostik erfolgt primär über den Nachweis von Taenia-Eiern in Stuhlproben. Problematisch bei der Taeniasis ist die speziesspezifische Diagnostik, insbesondere die Differenzierung zwischen den morphologisch identischen Eiern der beiden Arten T. saginata und Taenia solium, da die durch den Rinderbandwurm T. solium ausgelöste Erkrankung Zystizerkose lebensbedrohlich sein kann und spezifisch therapiert werden muss. In dieser Arbeit wurde die mögliche Identifizierung von T. saginata aus humanen Stuhlproben mittels matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie (MS) untersucht. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem mittels Laserbeschuss Proteine aus einer zu untersuchenden Probe gelöst werden, um anschließend anhand ihrer Größe und Fluggeschwindigkeit aufgetrennt und mittels eines Organismus-spezifischen Proteinspektrumprofils identifiziert zu werden. Diese Technik wird im mikrobiologischen Labor standardmäßig zur Identifikation von Bakterien und Pilzen angewendet, hat jedoch bisher kaum Anwendung zur Diagnostik von Parasiten gefunden Material und Methoden: Die Versuchsreihe wurde an acht in 0,45% Natriumchlorid gelagerten Proben durchgeführt, wobei es sich bei sechs Proben um T. saginata Proglottiden und bei zwei Proben um T. saginata Eier handelte. Es wurde ein in domo etabliertes Protokoll genutzt, die T. saginata Proben wurden umfangreich massenspektrometrisch analysiert und einer bestehenden in-house-database zur massenspektrometrischen Identifikation pathogenspezifischer Proteinspektren hinzugefügt. Es wurde eine externe Validierung durchgeführt, bei welcher die jeweils übrigen Proteinspektren der T. saginata Proben mit der in-house-database verglichen wurden. Die Genauigkeit der MALDI-TOF MS-basierten Identifizierung wurde mittels eines log score values (LSV) angegeben, der die Ähnlichkeit der Proteinspektren quantifiziert. Ein LSV zwischen 2,29-2,0 zeigt eine sichere Identifikation auf Speziesebene an, LSVs zwischen 1,7-1,9 hingegen zeigen eine sichere Identifikation auf Gattungsebene an. Ein LSV <1,7 spricht für eine unzureichend genaue Identifikation. Die Spezieszugehörigkeit aller Proben wurde molekulargenetisch mittels Sequenzierung des cox-1 Gens überprüft und phylogenetisch untersucht. Weiterführend wurde der Einfluss verschiedener Probenlagerungsmedien über einen Zeitraum von 24 Wochen auf die massenspektrometrische Identifikationsrate untersucht. Ergebnisse: Alle acht Proben der Versuchsreihe wurden mittels Sequenzierung als T. saginata identifiziert, es wurde auch eine phylogenetische Clusterung beobachtet. Nach Einfügen aller Proben in die konzipierte in-house-database konnten insgesamt sechs der acht untersuchten T. saginata Proben (75%) mindestens auf Gattungsebene verlässlich identifiziert und so von anderen Organismen differenziert werden. In drei Fällen konnte dabei auch eine speziesspezifische Identifikation erreicht werden. Zwei Proben wiesen jedoch keine Ähnlichkeiten mit der Referenzdatenbank. Die Identifikation von T. saginata konnte in den Probenlagerungsmedien 0,45% Natriumchlorid, 70% Ethanol sowie in Wasser von LC-MS Qualität gleichermaßen valide auch über einen Lagerungszeitraum von 24 Wochen durchgeführt werden. Lediglich für das Lagerungsmedium Formalin (37%) konnten keinerlei Proteinspektren generiert werden. Diskussion: Mittels MALDI-TOF MS kann eine Identifizierung von T. saginata auf Gattungsebene durchgeführt werden, jedoch bedarf die Methodik noch weiterer Optimierung hinsichtlich einer Standardisierung der Arbeitsprotokolle und Lagerungsbedingungen sowie weiterführender Untersuchungen mit einem vergrößerten Probenpool inklusive weiterer Taenia Arten unterschiedlichen geographischen Ursprungs, insbesondere T. solium. Ein weiterer Fokus sollte auf die Erweiterung der Referenzdatenbank gelegt werden, deren Qualität einen maßgeblichen Einfluss auf die massenspektrometrische Identifikationsgenauigkeit zeigt. Als Lagerungsmedien können 0,45% Natriumchlorid, 70% Ethanol sowie Wasser in LC-MSQualität gleichermaßen erfolgreich genutzt werden.

Introduction: Human infections with the tapeworm Taenia saginata can cause intestinal taeniasis, ranging from asymptomatic carriage to rare severe gastrointestinal symptoms. Taeniasis is mainly important in developing countries with poor sanitation standards but is increasingly becoming more significant to the Western world due to increasing globalization and migration. Diagnosis is primarily based on the detection of Taenia eggs in stool samples. Problematic with taeniasis is the species-specific diagnosis, especially the differentiation between the morphologically identical eggs of the two species T. saginata and Taenia solium, since cysticercosis caused by T. solium can be potentially life-threatening and accordingly requires increased attention including contact screening. In this work, we investigated the potential identification of T. saginata from human stool samples using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This technique uses laser bombardment to dislodge proteins, which are separated based on their size and flight speed, allowing them to be identified using an organism-specific protein spectrum profile. The technique is standardly used in diagnostic laboratories for the identification of bacteria and fungi but has little application to the diagnosis of parasites. Material and Methods: Six samples of T. saginata proglottids and two samples of T. saginata eggs, stored in sodium chloride 0,45%, were provided from our laboratory and from international partner laboratories. A before established protocol was used for sample processing. The T. saginata samples were analyzed by mass spectrometry and added to the existing in-house-database. An external validation was performed, in which the remaining protein spectra of the T. saginata samples were compared with the in-house-database. The accuracy of MALDI-TOF MS-based identification is indicated by a log score value (LSV), which quantifies the similarity of protein spectra. An LSV between 2.29-2.0 indicates confident identification at the species level, LSVs between 1.7-1.9 indicate confident identification at the genus level, and an LSV <1.7 indicates no confident identification. All samples were validated molecularly by sequencing of the cox-1 gene and further statistically analyzed looking for similarity in protein spectrum profiles and phylogenetic similarity of sequencing results. Further, the influence of different sample storage media over a period of 24 weeks on mass spectrometric identification was investigated. Results: All eight samples of the experimental series were correctly identified as T. saginata by sequencing, a phylogenetic clustering was also observed. After inserting all samples into the designed in-house database, six of the eight T. saginata samples could be reliably identified at least at the genus level and thus differentiated from other organisms. This corresponds to a percentage of 75%. In three cases, a species-specific identification could also be achieved. However, two samples did not show similarities with the reference database. No differences for the validation of T. saginata were detectable when the samples were stored in sodium chloride 0,45%, ethanol 70% or water with LC-MS quality for 24 weeks. For the storage media formalin 37% no protein spectra could be identified. Discussion: The use of MALDI-TOF MS as an identification tool for T. saginata was successful but the methodology needs further optimization regarding standardization of the working protocols and storage conditions as well as further investigations with an enlarged sample set with larger geographic variety and different species such as T. solium. Another focus should be the extension of the reference database, whose size shows a significant influence on mass spectrometric identification quality. Sodium chloride 0.45%, ethanol 70% as well as water in LC-MS quality can be used equally for subsequent MALDI-TOF MS analysis.