Quantifizierung der Fusion von CD63-positiven Vesikeln durch murine cytotoxische T- Lymphozyten mittels Echtzeit-Mikroskopie

Abstract

Bei der Interaktion einer cytotoxischen T-Zelle (CTL) mit einer virusbefallenen Zelle oder Krebszelle wird die CTL über den T-Zellrezeptor (engl. t-cell receptor, TCR) und den Ko-Rezeptor CD8 stimuliert. Zwischen CTL und Zielzelle (engl. target cell, TC) wird eine Immunsynapse (IS) ausgebildet und es kommt zu einer Polarisation der cytotoxischen Granula (CGs) zur IS. Schließlich fusionieren CGs an der IS mit Freisetzung ihres cytotoxischen Inhalts wie beispielsweise Perforin und Granzyme, um die TC zu zerstören. Es gibt zwei Klassen von CGs: „Single core granules“ (SCGs), die lösliche cytotoxische Proteine freisetzen, und „Multi core granules“ (MCGs), die supramolekulare Angriffpartikel (SMAPs) und teilweise auch Exosomen freisetzen. In den letzten Jahren wurde vermehrt berichtet, dass CTL mittels Freisetzung von extrazellulären Vesikeln (EVs) wie beispielsweise Exosomen einen weiteren Weg zur Kommunikation und zur Cytotoxizität nutzen. Bei Exosomen handelt es sich um EVs mit einer Größe von 30 -100 nm, die durch Fusion von multivesikulären Körpern (engl. multivesicular bodies, MVBs) mit der Plasmamembran freigesetzt werden. Wir wollten herausfinden, ob CD63 ein geeigneter Marker für MVBs und Exosomen von CTL ist und ob CTL Exosomen an der IS freisetzen. Zunächst untersuchten wir in murinen CTL die Lokalisation der Exosomenmarker CD63 und CD81, welche mit den fluoreszierenden Proteinen pHuji und pHluorin gekennzeichnet waren, in Bezug auf Granzym B (GzmB) als Marker für CGs mittels „Structured illumination“-Mikroskopie (SIM). Wir stellten eine signifikant höhere Ko-Lokalisation zwischen CD63 und GzmB als zwischen CD63 und CD81 oder CD81 und GzmB fest. Aufgrund der interessanten Ko-Lokalisation zwischen CD63 und GzmB entschieden wir uns dafür die Fusion CD63-pHuji positiver Vesikel mit interner Totalreflexions-fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) näher zu untersuchen. Hierfür säten wir CTL auf Anti-CD3-beschichtete Deckgläser aus, wodurch sie zum Ausbilden einer IS sowie zur Fusion CD63-pHuji positiver Vesikel stimuliert wurden. Wir stellten zwei Typen von CD63-pHuji positiven Fusionsereignissen fest: einen Typ mit einem schnellen Anstieg und einen schnellen Abfall der Fluoreszenzintensität und einen Typ mit einem schnellen Anstieg aber einem langsamen Abfall der Fluoreszenzintensität. Es bestand jedoch ein fließender Übergang zwischen beiden Typen. Weil Calcium eine wichtige Rolle für die Exozytose verschiedener Vesikel spielt, gingen wir der Frage nach, ob dies auch für die Fusion CD63-pHuji positiver Vesikel gilt und konnten nachweisen, dass signifikant mehr CD63-pHuji positive Fusionsereignisse in extrazellulären [Ca2+] von 10 mM als in einer extrazellulären [Ca2+] von ca. 0,1 µM auftraten. Als nächstes widmeten wir uns der Untersuchung der Position der CD63-pHuji positiven Fusionsereignisse an der IS. Die ringförmige Anreicherung von kortikalem F-Aktin definiert verschiedene funktionelle Bereiche der IS. Deshalb beobachteten wir gleichzeitig die Fusion CD63-pHuji positiver Fusionsereignisse und das mit Lifeact-eGFP markierte F-Aktin. Es traten signifikant mehr CD63-pHuji positive Fusionsereignisse innerhalb des Aktin-Rings auf. Zuletzt untersuchten wir in CTL von GzmB-mTFP-Knock-in-Mäusen, die CD63-pHuji überexprimierten, ob bei der Fusion CD63-pHuji positiver Vesikel GzmB freigesetzt wird. Signifikant mehr CD63-pHuji positive Fusionsereignisse waren GzmB-mTFP positiv als GzmB-mTFP negativ. Zusammenfassend lässt sich anhand der Literatur und der Ergebnisse dieser Arbeit feststellen, dass CD63 kein optimaler Marker für MVBs und Exosomen in CTL ist, weil es sich auch auf CGs befindet. Unsere Daten können wie folgt interpretiert werden: 1. Bei den GzmB-negativen CD63-pHuji-positiven Fusionsereignissen handelt es sich am ehesten um MVBs mit Freisetzung von Exosomen, 2. Bei den CD63-pHuji-positiven Fusionsereignissen mit Freisetzung von GzmB-mTFP - gekennzeichnet durch einen schnellen Abfall von der mTFP-Fluoreszenz - handelt es sich möglicherweise um SCGs und 3. bei CD63-pHuji-positiven und GzmB-mTFP-positiven Fusionsereignissen ohne Abfall von mTFP-Fluoreszenz um MCGs.

Summary of „Quantification of the fusion of CD63-positive ve-sicles by murine cytotoxic T-cells using real-time microscopy“ When a cytotoxic T cell (CTL) interacts with a virus-infected cell or cancer cell, the CTL is stim-ulated via the t-cell receptor (TCR) and the co-receptor CD8. An immune synapse (IS) is formed between the CTL and the target cell (TC) and the cytotoxic granules (CGs) polarize towards the IS. Eventually, CGs fuse at the IS, releasing their cytotoxic contents such as perforin and granzymes to destroy the TC. There are two classes of CGs: "single core granules" (SCGs), which release soluble cytotoxic proteins, and "multi core granules" (MCGs), which release su-pramolecular attack particles (SMAPs) and sometimes also exosomes. In recent years, there has been increasing evidence that CTL utilise another pathway for communication and cyto-toxicity via the release of extracellular vesicles (EVs) such as exosomes. Exosomes are EVs with 1 Zusammenfassung 3 a size of 30-100 nm that are released by fusion of multivesicular bodies (MVBs) with the plasma membrane. We wanted to find out whether CD63 is a suitable marker for MVBs and exosomes of CTL and whether CTL release exosomes at the IS. First, we investigated the local-ization of the exosome markers CD63 and CD81, which were labelled with the fluorescent proteins pHuji and pHluorin, in murine CTL in relation to granzyme B (GzmB) as a marker for CGs using structured illumination microscopy (SIM). We found a significantly higher co-locali-zation between CD63 and GzmB than between CD63 and CD81 or CD81 and GzmB. Due to the interesting co-localization between CD63 and GzmB, we decided to investigate the fusion of CD63-pHuji positive vesicles with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Therefore, we stimulated CTL by anti-CD3-coated coverslips that induced them to form an IS and to fuse CD63-pHuji positive vesicles. We detected two types of CD63-pHuji positive fusion events: one type with a rapid increase and a rapid decrease in fluorescence intensity and one type with a rapid increase but a slow decrease in fluorescence intensity. However, there was a fluid transition between the two types. Because calcium plays an important role in the exo-cytosis of various vesicles, we investigated whether this also applies to the fusion of CD63-pHuji positive vesicles and were able to demonstrate that significantly more CD63-pHuji posi-tive fusion events occurred in extracellular [Ca2+] of 10 mM than in an extracellular [Ca2+] of about 0.1 μM. Next, we investigated the position of CD63-pHuji positive fusion events at the IS by simultaneously observing the fusion of CD63-pHuji positive fusion events and F-actin labelled with Lifeact-eGFP. The accumulation of cortical F-actin defines different functional areas of the IS. Significantly more CD63-pHuji positive fusion events occurred within the actin ring. Finally, we studied in CTL of GzmB-mTFP knock-in mice overexpressing CD63-pHuji, whether GzmB is released by CD63-pHuji positive vesicles. Significantly more CD63-pHuji pos-itive fusion events were GzmB-mTFP positive than GzmB-mTFP negative. In conclusion, based on the literature and the results of this work, CD63 is not an ideal marker for MVBs and exo-somes in CTL because it is also present on CGs. Our data can be interpreted as follows: 1. the GzmB-negative CD63-pHuji positive fusion events are most likely to be MVBs with release of exosomes, 2. CD63-pHuji-positive fusion events with release of GzmB-mTFP - characterised by a rapid decrease in mTFP - are possibly SCGs and 3. CD63-pHuji-positive and GzmB-mTFP-pos-itive fusion events without a decrease in mTFP are MCGs.