Der Einfluss der Membranproteine GPR107 und GPR108 auf die Calciumhomöostase

Abstract

1.1 Der Einfluss der Membranproteine GPR107 und GPR108 auf die Calciumhomöostase Die Gruppe der G-Protein gekoppelten Rezeptoren stellt mit über 800 bekannten Re-zeptoren die größte Familie unter den humanen Membranproteinen dar und bildet dar-über hinaus eine der wichtigsten Zielstrukturen verschiedener medikamentöser Therapien. Dementsprechend stellt ein möglichst genaues Verständnis des Aufbaus sowie der Funktion der einzelnen G-Protein gekoppelten Rezeptoren eine wichtige Grundlage, unter anderem für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze, dar. Bei den beiden G-Protein gekoppelten Rezeptoren 107 und 108 handelt es sich um zwei bisher nur wenig erforschte Mitglieder dieser Proteinfamilie. Dabei konnte für beide Proteine bisher weder die exakte Struktur noch ein jeweiliger Ligand oder die exakte intrazelluläre Signalkaskade, über welche die beiden Rezeptoren agieren, identifiziert werden. Entsprechend werden sowohl das GPR107- als auch das GPR108-Protein lediglich aufgrund ihrer prognostizierten Struktur mit sieben potentiellen Transmembrandomänen der Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren zugeordnet. Für ein genaueres Verständnis dieser Rezeptoren wurden im Rahmen dieser Arbeit einerseits die intrazelluläre Lokalisation und eine mögliche Spaltung des GPR107- und des GPR108-Proteins sowie andererseits funktionelle Aspekte, insbesondere der Einfluss der beiden Proteine auf die intrazelluläre Calciumhomöostase, näher betrachtet. Während für das GPR107-Protein bereits eine Protease-Schnittstelle sowie eine zumindest partielle Lokalisation des Proteins im Golgi-Apparat beschrieben ist, zeigt sich dies für das GPR108-Protein noch weitgehend unklar. Aus diesem Grund erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zunächst die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation des GPR108-Proteins sowie die Betrachtung potentieller Schnittstellen innerhalb des Proteins. Für die intrazelluläre Lokalisation des GPR108-Proteins stellte sich hierbei fluoreszenzmikroskopisch eine deutliche Abhängigkeit der Lokalisation des N-terminalen GPR108-Proteins von der gleichzeitigen Expression des C-terminalen Proteinabschnitts dar. Während das N-terminale GPR108-Protein ohne den C-Terminus überwiegend im endoplasmatischen Retikulum detektiert werden kann, zeigt sich bei Expression der gesamten GPR108-Proteinsequenz eine deutliche Anreicherung des N-terminalen Proteinabschnitts im Golgi-Apparat sowie in kleinen Vesikeln, welche insbesondere in den Zellausläufern lokalisiert sind. Dementsprechend scheint der C-Terminus hier eine 2 wichtige Voraussetzung für den Austritt des N-terminalen GPR108-Proteins aus dem endoplasmatischen Retikulum dazustellen. Für den C-terminalen Abschnitt des GPR108-Proteins, welcher die Transmembrandomänen enthält, zeigt sich hingegen unabhängig von der zeitgleichen Expression des N-terminalen Proteinabschnitts eine Lokalisation in kleinen Vesikeln, welche über große Teile der Zelle verteilt vorliegen. Lediglich in sehr stark exprimierenden Zellen lässt sich die für die Transmembrandomänen zu erwartende Lokalisation in der Zellmembran detektieren. Hinsichtlich einer potentiellen Spaltung des GPR108-Proteins ergaben sich in der mikroskopischen Betrachtung zwar deutliche Hinweise auf eine Spaltung des GPR108-Proteins innerhalb der Zelle, jedoch konnte weder durch Fluoreszenzmikroskopie noch durch Untersuchungen mittels Western Blot ein Motiv innerhalb des Proteins als Schnittstellensequenz identifiziert werden. Im Gegensatz hierzu scheint sich die Lokalisation der Protease-Schnittstelle innerhalb des strukturverwandten GPR107-Proteins deutlich klarer darzustellen. Vorige Arbeiten identifizierten dabei insbesondere mittels molekularbiologischer Untersuchungen im Western Blot eine KSKR-Sequenz vor den Transmembrandomänen als Schnittstelle für die Protease Furin. Ergänzend erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die mikroskopische Untersuchung dieser Schnittstelle. Unter Mutation dieser KSKR-Sequenz sowie durch Markierung beider Proteintermini mittels verschiedener Fluoreszenzproteine ließ sich diese Sequenz auch mikroskopisch als Schnittstellenmotiv des Proteins bestätigen. Neben den Betrachtungen der beiden Rezeptoren GPR107 und GPR108 hinsichtlich einer potentiellen Spaltung sowie ihrer intrazellulären Lokalisation erfolgte im Rahmen dieser Arbeit vorrangig die Untersuchung funktioneller Aspekte der beiden Proteine, insbesondere deren Einfluss auf die intrazelluläre Calciumhomöostase mittels Calcium Imaging. Hierbei zeigte sich zunächst ein gegenüber den Kontrollzellen signifikant erhöhter Calciumeinstrom in GPR107 exprimierende Zellen infolge einer Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration. Weiterhin ließ sich dieser Effekt des GPR107-Proteins nach separater Expression des N- sowie C-terminalen Proteinabschnitts klar dem C-terminalen Abschnitt des GPR107-Proteins zuordnen. Der N-Terminus hingegen zeigte keinen wesentlichen Einfluss auf diesen Effekt. Im Gegensatz zu diesen Beobachtungen bei Expression des GPR107-Proteins resultiert die Expression des GPR108-Proteins lediglich in einem geringgradigen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration infolge einer Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration. Dementsprechend scheint das GPR108-Protein keinen wesentlichen Einfluss auf den Calciumeinstrom in Zellen aufzuweisen. Weiterführend zeigte sich für die beiden G-Protein gekoppelten Rezeptoren 107 und 108 eine ausgeprägte Auswirkung auf intrazelluläre Calciumspeicher. Sowohl bei Expression 3 des GPR107- als auch bei Expression des GPR108-Proteins stellte sich die, durch Applikation von Carbachol oder Thapsigargin induzierte, Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern signifikant verringert gegenüber Kontrollzellen dar. Somit scheint hier ein ursächlicher, mit der Expression der beiden Rezeptoren GPR107 beziehungsweise GPR108 einhergehender, verringerter Füllungszustand dieser Speicher wahrscheinlich. Bei näherer Betrachtung dieser Auswirkungen der beiden Proteine gelang auch hier nach separater Expression der jeweilgen N- und C-Termini der Rezeptoren eine klare Zurodnung dieses Effektes zu den C-terminalen Proteinabschnitten. Während unter alleiniger Expression der C-Termini eine gleichartige, beziehungsweise im Falle des GPR108-Proteins eine nochmals signifikant stärkere Verringerung der intrazellulären Calciumfreisetzung beobachtet werden kann, zeigte sich unter alleiniger Expression der jeweiligen N-Termini diesbezüglich keine wesentliche Auswirkung. Als dritten zu beobachtenden Effekt hinsichtlich der zellulären Calciumhomöostase ließ sich bei Expression des GPR107-Proteins eine signifikante Erhöhung der basalen intrazellulären Calciumkonzentration verzeichnen. Aufgrund der deutlichen Strukturverwandtschaft der beiden Proteine GPR107 und GPR108 zueinander sowie lediglich sehr geringer struktureller Ähnlichkeit mit anderen G-Protein gekoppelten Rezeptoren wurde in dieser Arbeit des Weiteren eine mögliche Interaktion dieser beiden Proteine untersucht. Hierbei ergaben sich sowohl in Bezug auf den Calciumeinstrom in die Zellen als auch hinsichtlich der Carbachol-induzierten Calci-umfreisetzung aus intrazellulären Speichern keine Hinweise auf eine diesbezügliche In-teraktion der beiden Rezeptoren. Neben den funktionellen Auswirkungen auf die intrazelluläre Calciumhomöostase erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zudem die Betrachtung verschiedener, den beobachteten Effekten potentiell zugrundeliegenden, G-Protein gekoppelter Signalkaskaden. In erster Linie wurde hierfür das GPR107-Protein näher untersucht. Eine erste allgemeine Untersuchung eines G-Protein gekoppelten Signalwegs des GPR107-Proteins erfolgte dabei mit Suramin, unter dessen Einfluss eine Inhibierung der Aktivierung aller G-Proteine resultiert. Da sich die Effekte des GPR107-Proteins unter diesem Einfluss jedoch nicht wesentlich veränderten, bleibt hierbei eine Bestätigung des Agierens des GPR107-Proteins über ein G-Protein aus. Aufgrund bereits vorliegender Untersuchungen, welche keine Hinweise auf einen cAMP-vermittelten Signalweg des GPR107-Proteins erkennen ließen, erfolgte im weiteren Ver-lauf dieser Arbeit insbesondere die Betrachtung einer konstitutiven Gi-Aktivierung durch das GPR107- beziehungsweise das GPR108-Protein sowie eines Agierens des GPR107-Proteins über die Phospholipase C. Hierbei ergaben sich jedoch keine 4 Anhaltspunkte für das Wirken der beiden G-Protein gekoppelten Rezeptoren 107 und 108 über eine dieser Signalkaskaden. Für eine weiterführende Untersuchung des GPR107-Proteins hinsichtlich der Charakte-ristik eines G-Protein gekoppelten Rezeptors erfolgte darum die Betrachtung der poten-tiellen G-Protein-Bindungsstelle des Proteins. Entgegen der Vermutungen resultierte hierbei nach Modifikation der wahrscheinlichen G-Protein-Bindungsposition innerhalb des dritten intrazellulären Loops der Transmembrandomänen keine Verringerung der Effekte des GPR107-Proteins, sondern im Gegensatz sogar eine signifikante Verstär-kung. Dies ließ sich dabei sowohl für den Calciumeinstrom in GPR107 exprimierende Zellen als auch für die Carbachol-induzierte intrazelluläre Calciumfreisetzung verzeich-nen. Eine klare Identifikation dieser Sequenz als G-Protein-Bindungsstelle des GPR107-Proteins blieb hiermit zwar aus, jedoch scheint diese Aminosäuresequenz innerhalb des dritten intrazellulären Loops den Einfluss des GPR107-Proteins auf die Calciumhomöo-stase wesentlich zu beeinflussen. Da die exakte Anzahl an Transmembrandomänen bisher nicht bekannt ist, wurde neben der Untersuchung der einzelnen G-Protein gekoppelten intrazellulären Signalkaskaden auch die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass das GPR107-Protein potentiell einen Ionenkanal mit sechs putativen Transmembrandomänen darstellen könnte. Für eine diesbezügliche Untersuchung wurden innerhalb einer putativen Poren-ähnlichen Region negativ geladene Aminosäuren durch neutrale ersetzt. Diese Modifikation zeigte jedoch keinen Einfluss auf den mit der Expression des GPR107-Proteins einhergehenden er-höhten Calciumeinstrom in Zellen. Somit scheint es eher unwahrscheinlich, dass das GPR107-Protein einen Calcium-permeablen Ionenkanal bildet. Da sowohl für das GPR107- als auch für das GPR108-Protein bisher keine Liganden bekannt sind und diese somit der Gruppe der orphan G-Protein Rezeptoren zugeordnet werden, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit auch die Untersuchung einiger potentieller Liganden für das GPR107-Protein. Hierbei wurden aufgrund der erheblichen Einflüsse des GPR107-Proteins in Bezug auf den Calciumeinstrom sowie die intrazelluläre Calci-umfreisetzung insbesondere Liganden untersucht, welche ebenfalls die Calciumhomöo-stase beeinflussen. Zunächst erfolgte die Betrachtung einer potentiellen Interaktion des GPR107-Proteins mit verschiedenen Glucocorticoiden. Die untersuchten Glucocorti-coide Beclomethason, Corticosteron, Dexamethason, Hydrocortison und Prednisolon21-Acetat beeinflussten hierbei die Auswirkungen des GPR107-Proteins auf den intrazellu-lären Calciumhaushalt in keinem wesentlichen Ausmaß, sodass sich hierdurch kein Hin-weis auf eine Interaktion beziehungsweise ein Fungieren dieser Glucocorticoide als Lig-anden des GPR107-Proteins ergibt. 5 Auch das polyvalente Kation Neomycin wurde in dieser Arbeit als potentieller Ligand des GPR107-Proteins untersucht. Neomycin aktiviert den Calcium-sensing receptor (CaSR), welcher durch seine Funktion als Calciumsensor an der zellulären Reaktion auf eine veränderte extrazelluläre Calciumkonzentration beteiligt ist. Untersucht wurde, inwieweit Neomycin auch das GPR107-Protein aktiviert. Hierbei ergaben sich keine Anhaltspunkte für eine Interaktion des GPR107-Proteins mit dem Neomycin beziehungsweise auf eine hiermit potentiell einhergehende Charakteristik des GPR107-Proteins als Calci-umsensor. Da mehrere Arbeiten darauf hindeuten, dass das GPR107-Protein mit dem Peptidhor-mon Neuronostatin interagiert, wurde abschließend auch Neuronostatin als möglicher Ligand des GPR107-Proteins untersucht. Interessanterweise scheint auch Neuronosta-tin die intrazelluläre Calciumhomöostase zu beeinflussen, wobei die hier zugrundliegen-den intrazellulären Signalwege sowie beteiligte Rezeptoren bisher weitgehend unbe-kannt sind. Für den erhöhten Calciumeinstrom in die Zelle, welche unter Expression des GPR107-Proteins zu beobachten ist, zeigte sich keine wesentliche Auswirkung bei Be-trachtung dieses Effektes unter dem Einfluss von Neuronostatin. Im Gegensatz hierzu stellte sich die mit der Expression des GPR107-Proteins einhergehende Verringerung der Calciumfreisetzung aus intrazellulären Speichern unter dem Einfluss von Neurono-statin zwar lediglich gering, jedoch signifikant stärker verringert dar. Inwieweit diese Aus-wirkung auf eine tatsächliche Interaktion des Neuronostatins mit dem G-Protein gekop-pelten Rezeptor 107 und eine hierdurch bedingte Neuronostatin-induzierte Verstärkung des GPR107-Effekts zurückzuführen ist, ist unklar. Ein genaues Verständnis der hier zugrundeliegenden Mechanismen obliegt somit künftigen Untersuchungen.

1.2 The influence of the membrane proteins GPR107 and GPR108 on calcium homeostasis With more than 800 known receptors, the group of G protein-coupled receptors re-presents the largest family of human membrane proteins and forms one of the most important target structures of various drug therapies. Therefore, a precise understanding of the structure and function of these G protein-coupled receptors is an important basis for, among others the development of new therapeutic approaches. The two G protein-coupled receptors 107 and 108 are two members of this protein family that have been little explored so far. For both proteins neither the exact structure nor a respective ligand or the exact intracellular signaling pathway through which the two re-ceptors act could be identified. Accordingly, the GPR107 and GPR108 protein are both assigned to the superfamily of G protein-coupled receptors solely because of their pre-dicted structure with seven potential transmembrane domains. For a more detailed un-derstanding of these receptors, the intracellular localization and a possible cleavage site of the GPR107 and GPR108 protein were examined in more detail in this thesis. Further-more, functional aspects, in particular the influence of the two proteins on intracellular calcium homeostasis were explored as well. While for the GPR107 protein a protease cleavage site and a partial localization in the Golgi apparatus have already been described, these aspects largely have yet to be de-termined for the GPR108 protein. For this reason, the intracellular localization of the GPR108 protein and the consideration of potential cleavage sites within the protein were investigated in this thesis. In case of the intracellular localization of the GPR108 protein, fluorescence microscopy showed a clear dependence regarding the localization of the N-terminal GPR108 protein on the simultaneous expression of the C-terminal protein segment. Without the C-terminal GPR108 protein the N-terminus can be detected pre-dominantly in the endoplasmic reticulum. In contrast, when the entire protein sequence of the GPR108 protein is expressed, there is a clear enrichment of the N-terminal protein section in the Golgi apparatus and in small vesicles, which are localized in particular in the cell extensions. Therefore, the C-terminus seems to be an important prerequisite regarding the exit of the N-terminal GPR108 protein from the endoplasmic reticulum. The C-terminal section of the GPR108 protein, which contains the transmembrane domains, localizes in small vesicles, which are distributed over large parts of the cell whereas the localization in the cell membrane, expected for the transmembrane domains can only be seen in very strongly expressing cells. This can be found independently from the simul-taneous expression of the N-terminal protein section. 7 With regard to a potential cleavage site of the GPR108 protein, microscopic observation revealed clear indications of a cleavage within the cell, but neither fluorescence microscopy nor Western blot investigations could identify an unambiguously cleavage sequence. In contrast, the localization of the protease cleavage site within the structurally related GPR107 protein appears to be much clearer. Previous studies, in particular molecular-biological investigations by means of Western blots identified a KSKR sequence prece-ding the transmembrane domains as a cleavage site for the protease furin. As part of this thesis the cleavage site was supplementary carried out by microscopic examination. By mutating the KSKR sequence and by marking both protein termini with different flu-orescent proteins, this sequence could also be confirmed microscopically as the cleavage site of the protein. In addition to the examinations of the two receptors GPR107 and GPR108 with regard to a potential cleavage site and their intracellular localization, the functional aspects of the two proteins have been investigated. Therefor particularly their influence on the in-tracellular calcium homeostasis was explored by calcium imaging in this study. In com-parison to the control cells, cells expressing the GPR107 protein showed a significantly strengthened calcium influx as a result of an increase in the extracellular calcium con-centration. Furthermore, after separate expression of the N- and C-terminal protein sec-tion, this effect could be clearly assigned to the C-terminal section of the GPR107 protein. The N-terminus showed no significant influence on this effect. In contrast to these observations in case of expression of the GPR107 protein, expres-sion of the GPR108 protein results in only a slight rising of intracellular calcium concent-ration as a consequence of an increase in extracellular calcium concentration. Accordin-gly, the GPR108 protein does not appear to have any significant impact on calcium influx into cells. Further, the two G protein-coupled receptors 107 and 108 showed a considerable effect on intracellular calcium stores. After expression of the GPR107 protein as well as after expression of the GPR108 protein, the release of calcium from intracellular stores in-duced by application of carbachol or thapsigargin was significantly reduced compared to control cells. This indicates a probable underlying reduced filling state of intracellular calcium stores, caused by expression of the GPR107 and GPR108 protein. On closer examination of these results, when the respective N- and C-termini of the receptors were expressed separately, it was also possible to clearly assign this effect to the C-terminal protein sections. While there can be observed a similar reduction in intracellular calcium release, or in case of the GPR108 protein a significantly stronger reduction, when the C- 8 termini are expressed solely, there was no significant effect when the respective N-ter-mini were expressed alone. The third effect to be determined with regard to cellular calcium homeostasis was a sig-nificant increase in the basal intracellular calcium concentration when the GPR107 pro-tein was expressed. Due to the clear structural relationship between the two proteins GPR107 and GPR108 and only very low structural similarity to other G protein-coupled receptors, a possible interaction of these two proteins was also investigated in this thesis. In this context, neit-her in regard to the influx of calcium into the cells nor to the release of calcium from its intracellular stores, induced by carbachol, there were any indications of an interaction between these two receptors. In addition to the functional effects on the intracellular calcium homeostasis, this study also considered various G protein-coupled signaling pathways that potentially underlie the observed effects. First and foremost, the GPR107 protein was examined more closely for this purpose. A first general investigation of a G protein-coupled signaling pathway of the GPR107 protein was performed with suramin, under which influence an inhibition of the activation of all G proteins results. Since the effects of the GPR107 pro-tein were not significantly different under this influence, there is no confirmation of the GPR107 protein acting via a G protein. Based on existing studies, which did not reveal any evidence of a cAMP-mediated sig-naling pathway of the GPR107 protein, this thesis further focused in particular on a con-stitutive Gi activation by the GPR107 or GPR108 protein as well as a mechanism of the GPR107 protein via phospholipase C. As a result, no evidence for an operation of the two G protein-coupled receptors 107 and 108 via one of these signaling pathways could have been observed. For a further investigation with regard to the characteristics of a G protein-coupled re-ceptor, the potential G protein binding site of the GPR107 protein was explored. Contrary to assumptions, the modification of the probable G protein binding site within the third intracellular loop of the transmembrane domains did not result in a reduction in the effects of the GPR107 protein, but even in a significant increase. This was recorded both for the calcium influx into GPR107 expressing cells and for the intracellular calcium re-lease, induced by carbachol. Although consequently, this sequence was not clearly iden-tified as the G protein binding site of the GPR107 protein, this amino acid sequence within the third intracellular loop appears to have a significant influence on the effects of the GPR107 protein on calcium homeostasis. Since the exact number of transmembrane domains is not yet known, the possibility that the GPR107 protein could potentially represent an ion channel with six putative 9 transmembrane domains was taken into consideration in addition to the examination of the different G protein-coupled intracellular signaling pathways. To investigate this, ne-gatively charged amino acids were replaced by neutral ones within a putative pore-like region. However, this modification showed no influence on the increased calcium influx into cells associated with the expression of the GPR107 protein. Therefore, it seems rather unlikely that the GPR107 protein forms a calcium-permeable ion channel. Since no ligands are yet known for either the GPR107 or GPR108 protein, both proteins are consequently assigned to the group of orphan G protein-coupled receptors. For this reason, this thesis also included the investigation of some potential ligands for the GPR107 protein. Due to the significant influence of the GPR107 protein on calcium influx and intracellular calcium release, ligands in particular were investigated which are also having an influence on calcium homeostasis. First, a potential interaction of the GPR107 protein with various glucocorticoids was explored. The investigated glucocorticoids beclomethasone, corticosterone, dexamethasone, hydrocortisone and prednisolone21-acetate did not influence the effects of the GPR107 protein on the intracellular calcium homeostasis to any significant extent. In consequence there is no indication of an inter-action or a function of these glucocorticoids as a ligand of the GPR107 protein. The polyvalent cation neomycin was also examined as a potential ligand of the GPR107 protein in this thesis. Neomycin activates the calcium-sensing receptor (CaSR), which, through its function as a calcium sensor, is involved in the cellular response to a changed extracellular calcium concentration. Whether neomycin also activates the GPR107 pro-tein was investigated. There were no indications of an interaction of the GPR107 protein with neomycin or of a potentially associated characteristic of the GPR107 protein as a calcium sensor. Since several studies indicate that the GPR107 protein interacts with the peptide hor-mone neuronostatin, neuronostatin was finally also examined as a possible ligand of the GPR107 protein. Interestingly, neuronostatin also appears to influence intracellular cal-cium homeostasis, whereby the underlying intracellular signaling pathways and the re-ceptors involved are yet largely unknown. For the increased calcium influx into the cells, which can be observed under the expression of the GPR107 protein, there was no sig-nificant effect when this impact was explored with the influence of neuronostatin. In con-trast, the calcium release from intracellular stores, which is significantly reduced under the expression of the GPR107 protein, turned out to be slightly, but significantly further reduced with neuronostatin. It is unclear to what extent this effect can be attributed to an actual interaction of neuronostatin with the G protein-coupled receptor 107 and an in-crease of this GPR107 effect induced by neuronostatin. A precise understanding of the underlying mechanisms is therefore a matter of future investigations.