Untersuchung zur Interaktion zwischen Apatit-Nanopartikeln und oralen Proteinen

Abstract

Nanopartikel werden in der Medizin vielfältig für diagnostische und therapeutische Zwecke ein- gesetzt. In der Zahnmedizin bieten sie neue Möglichkeiten zur Reparatur und sogar Regeneration von Zahnhartsubstanz. Ein direkter Kontakt zwischen Nanopartikeln und der Zahnoberfläche ist dabei essenziell. In der Mundhöhle wird dieser Kontakt jedoch durch verschiedene Faktoren, insbesondere durch organisches Material wie Proteine, verlangsamt oder verhindert. Die Proteine im Speichel binden sich an die Nanopartikel unmittelbar nach ihrem Eintritt in das orale System und bilden eine sogenannte Protein-Korona. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion zwischen drei verschiedenen Apatit- Nanopartikeln und oralen Proteinen untersucht, sowie die Struktur der dabei entstehen- den Nanopartikel-Protein-Komplexe dargestellt. Hierzu wurden die Apatit-Nanopartikel als Nanopartikel-Wasser-Suspension entweder in vitro in Speichel inkubiert oder in situ als Spülung in die Mundhöhle eingebracht. Nach einer Inkubationszeit von drei Minuten bzw. zwei Stunden oder einer Spüldauer von ein bzw. fünf Minuten wurden die Nanopartikel-Protein-Komplexe durch Zentrifugation aus dem Speichel isoliert. Das an den Nanopartikeln adsorbierte Protein wurde mittels BCA-Analyse (Bicinchoninic Acid Assay) nachgewiesen und quantitativ bestimmt. Die Struktur der Nanopartikel-Protein-Komplexe wurde mithilfe der Transmissionselektronen- mikroskopie (TEM) dargestellt. Sowohl aus den in vitro- als auch den in situ-Experimenten wurde eine ausreichende Menge an Nanopartikel-Protein-Komplexen gewonnen. Die Interaktion zwischen den Nanopartikeln und den Speichelproteinen konnte für alle drei untersuchten Nano- partikel nachgewiesen werden. Die quantitative Analyse zeigte, dass Größe und Morphologie der Nanopartikel ihre Interaktion mit Proteinen beeinflussen. Eine einheitliche Korrelation zwischen der Menge des adsorbierten Proteins und der Inkubationszeit konnte jedoch nicht festgestellt werden. Unterschiede in der Proteinmenge nach einer Inkubationszeit von drei Minuten bzw. zwei Stunden deuten auf eine Modifikation des adsorbierten Proteins hin. Die Struktur der Nanopartikel-Protein-Komplexe wurde mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Neben den überwiegend beobachteten Nanopartikel-Agglomeraten und -Aggregaten konnten auch einzelne Nanopartikel mit adsorbierten Proteinen identifiziert werden. Durch Ätzen wurde die Trennung des anorganischen vom organischen Material ermöglicht. Eine strukturelle Ähnlichkeit zwischen den adsorbierten Proteinen und einer in situ gebildeten Pellikel konnte festgestellt werden. Um die Eigenschaften und das Verhalten der Apatit-Nanopartikel im oralen Milieu besser zu verstehen, sind weiterführende Untersuchungen zur Zusammensetzung der Proteinkorona, den Mechanismen der Proteinadsorption sowie eine umfassende und präzise Charakterisierung der Nanopartikel erforderlich.

1.2 Abstract Nanoparticles have been applied for various diagnostic and therapeutic purposes in the medical field. In dentistry, they offer new possibilities for the repair and even regeneration of dental hard tissue. Direct contact between nanoparticles and the tooth surface is essential for these processes. However, in the oral cavity, this contact is often slowed or inhibited by various factors, particularly organic materials such as proteins. Proteins in saliva bind to the nanoparticles immediately upon their entry into the oral environment, forming what is known as a protein corona. In the present work, the interaction between three different types of apatite nanoparticles and oral proteins, as well as the structure of the resulting nanoparticle-protein complexes, was investigated. For the experiment, a nanoparticle-water suspension was used, which was either incubated in vitro in saliva or applied in situ as a mouthwash in the oral cavity. After incubation times of three minutes or two hours, or rinsing times of one or five minutes, the nanoparticle-protein complexes were isolated by centrifugation. The proteins adsorbed onto the nanoparticles were detected and quantified using the Bicinchoninic Acid Assay (BCA Assay). The structure of the nanoparticle-protein complexes was revealed using transmission electron microscopy (TEM). Sufficient amounts of nanoparticle-protein complexes were obtained from both the in vitro and in situ experiments. The interaction between the nanoparticles and salivary proteins was confirmed for all three types of nanoparticles. Quantitative analysis showed that the size and morphology of the nanoparticles influenced their interaction with proteins. However, no consistent correlation between the amount of adsorbed protein and the incubation time was observed. Differences in the amount of adsorbed protein after incubation times of three minutes and two hours suggest a modification of the adsorbed proteins. The structure of the nanoparticle-protein complexes was examined using TEM. In addition to the predominantly observed agglomerates or aggregates of nanoparticles, individual nanoparticles with adsorbed proteins were also identified. Separation of inorganic and organic materials was achieved through acid etching. A structural similarity between the adsorbed proteins and an in situ formed pellicle was noted. To fully understand the properties and behavior of apatite nanoparticles in the oral environment, further studies are required. These should particularly focus on the composition of the protein corona, the mechanisms of protein adsorption, and a comprehensive and precise characterization of the nanoparticles.