Analyse der Gen- und Proteinexpression von Limbusfibroblasten in einer indirekten Kokultur mit Limbusepithelzellen im Kontext der kongenitalen Aniridie

Abstract

2.1 Deutsche Zusammenfassung Zielsetzung: Bei der kongenitalen Aniridie, die mehrheitlich auf einer Mutation in einer PAX6-Genkopie beruht, kommt es mit fortschreitendem Lebensalter zur Konjunktivalisierung der transparenten Hornhaut. Die pathophysiologischen Mechanismen hinter der PAX6-Haploinsuffizienz bei der Entwicklung der Aniridie-assoziierten Keratopathie (AAK) sind gegenwärtig noch unzureichend verstanden. Es wird angenommen, dass der Limbusstammzellinsuffizienz, die aus einem kombinierten Mangel an epithelialen Vorläuferzellen und der Zerstörung der limbalen Nischenstruktur resultiert, eine zentrale Bedeutung zukommt. Das Überleben, die Proliferation und Differenzierung der limbalen Epithelstammzellen wird in einer dynamischen Mikroumgebung unter anderem durch Interaktion mit spezialisierten Nischenzellen, wie sie im limbalen Hornhautstroma vorzufinden sind, gewährleistet. Ziel der Arbeit war die Untersuchung einer differenziellen Gen- und Proteinexpression von limbalen Fibroblasten in einer indirekten Kokultur mit Epithelzellen der Limbusregion im Kontext der kongenitalen Aniridie, um dysregulierte Komponenten in der Interaktion dieser Zelltypen zu identifizieren. Methoden: Limbusfibroblasten von sechs gesunden Hornhautspendern (LFC) und von fünf Patienten mit AAK (AN-LFC) wurden isoliert und für 48 Stunden in vitro in einer indirekten Kokultur mit konditioniertem Medium von primären Limbusepithelzellen (pLEC-CM) oder von einer Aniridie-Epithelzelllinie (mut-LSC-CM) inkubiert. Die Genexpressionsanalyse erfolgte mittels qPCR von dem Transkriptionsfaktor PAX6, von Enzymen und Strukturproteinen der extrazellulären Matrix (COL1A1, COL4A1, HAS2, MMP2, MMP9, TIMP1), von Wachstumsfaktoren (HGF, TGF-β1), vom Differenzierungsmarker ACTA2/α-SMA und von inflammatorischen Markern (NFkB, IL6, CCL2, VEGFA). Die Proteinexpression der Biomarker MMP9, HGF, IL6 und VEGFA wurde mittels ELISA und die Proteinexpression von MMP9, α-SMA und NFkB wurde mittels Western Blot untersucht. Die statistische Auswertung wurde unter Verwendung einer Two-way ANOVA mit nachfolgendem Dunnett´s Test und bei Vergleich zwischen LFC und AN-LFC mithilfe eines Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt. Ergebnisse: Limbusfibroblasten exprimieren kaum nachweisbare Mengen an PAX6 (LFC: Ctmean=31,58 / AN-LFC: Ctmean=32,85) und die Behandlung mit konditioniertem Medium führte zu keiner signifikanten Erhöhung der Genexpression von PAX6. Es konnten keine signifikanten Unterschiede in der Genexpression von COL1A1, COL4A1, HAS2, MMP2, MMP9, TIMP1, HGF, TGF-β1 und NFkB zwischen den LFC- und AN-LFC-Populationen festgestellt werden. Die Inkubation mit pLEC-CM führte bei den AN-LFC zu einer signifikanten Hochregulierung der Genexpression von COL4A1 (p=0,008) und von MMP2 (p=0,01). Vor 4 dem Kontakt mit den Limbusfibroblasten war die Proteinkonzentration von MMP9 im pLEC-CM mit 1120 pg/ml deutlich höher als im mut-LSC-CM mit 162 pg/ml. Im Vergleich zur zugehörigen LFC-Kontrollgruppe konnte bei den AN-LFC mit pLEC-CM eine verminderte Genexpression von ACTA2 (p=0,03) gemessen werden. Die Inkubation mit pLEC-CM führte in der LFC-Gruppe zu einer signifikanten Hochregulierung der Gen- (p=0,002) und Proteinexpression (p<0,0001) von IL6. In der AN-LFC-Gruppe ergab sich hingegen mit dem mut-LSC-CM keine Veränderung der Gen- oder Proteinexpression von IL6. Analog hierzu zeigte sich bei den LFC mit pLEC-CM eine signifikante Zunahme der CCL2-Genexpression (p=0,001), in der AN-LFC-Gruppe mit mut-LSC-CM jedoch keine Veränderung. Die Proteinexpression von VEGFA war in der AN-LFC-Population mit pLEC-CM verglichen mit der zugehörigen LFC-Kontrollgruppe signifikant vermindert (p=0,02). Schlussfolgerung: Im Rahmen der kongenitalen Aniridie führt die PAX6-Haploinsuffizienz trotz eines ohnehin niedrigen PAX6-Expressionsniveaus zu Veränderungen in der Zellphysiologie der Limbusfibroblasten, insbesondere bei der Expression von IL6, ACTA2 und VEGFA. Die AN-LFC zeigen mit dem Kontrollmedium keine Dysregulation der untersuchten Biomarker der extrazellulären Matrix (COL1A1, COL4A1, HAS2, MMP2, MMP9, TIMP1, HGF und TGF-β1) auf transkriptioneller Ebene nach 48 Stunden, sodass die histopathologischen Veränderungen der AAK die Folge eines metabolisch angeregten Zustands wie beispielsweise bei einem anhaltenden entzündlichen Prozess darstellen könnten. Die verminderte Genexpression von ACTA2 könnte auf eine schnellere Metabolisierungsrate profibrotischer Moleküle durch die AN-LFC hinweisen. Weiterhin ist ein unterschiedliches Reaktionsverhalten der Limbusfibroblasten auf ihr zugehöriges konditioniertes Medium (LFC mit pLEC-CM und AN-LFC mit mut-LSC-CM) nach 48 Stunden evident, welches eine gestörte Interaktion zwischen den Epithelzellen und ihren Nischenzellen anzeigen könnte.

2.2 Summary Purpose: With increasing age, individuals with congenital aniridia, which is mainly due to a mutation in one PAX6 gene copy, typically exhibit conjunctivalization of the transparent cornea. The pathophysiological mechanisms following the PAX6 haploinsufficiency in the development of aniridia-associated keratopathy (AAK) are currently not sufficiently elucidated. Limbal stem cell deficiency, resulting from a combined lack of epithelial progenitor cells and destruction of the limbal niche structure, is believed to play a central role. The survival, proliferation, and differentiation of limbal epithelial stem cells is ensured in a dynamic microenvironment by interaction with specialized niche cells, such as those found in the limbal stroma. The aim of this study was to investigate the differential gene and protein expression of limbal fibroblasts in an indirect coculture with epithelial cells of the limbal region in the context of congenital aniridia, in order to identify dysregulated components in the interaction of these cell types. Methods: Limbal fibroblasts from six healthy corneal donors (LFC) and from five patients with AAK (AN-LFC) were isolated and incubated for 48 hours in vitro in an indirect coculture with conditioned medium from primary limbal epithelial cells (pLEC-CM) or from an aniridia epithelial cell line (mut-LSC-CM). Gene expression analysis was conducted by qPCR of the transcription factor PAX6, of enzymes and structural proteins of the extracellular matrix (COL1A1, COL4A1, HAS2, MMP2, MMP9, TIMP1), of growth factors (HGF, TGF-β1), of the differentiation marker ACTA2/α-SMA and of inflammatory markers (NFkB, IL6, CCL2, VEGFA). The protein expression of the biomarkers MMP9, HGF, IL6 and VEGFA was assessed by ELISA and the protein expression of MMP9, α-SMA and NFkB was assessed by western blot. Statistical analysis was performed using a Two-way ANOVA followed by Dunnett´s test and a Mann-Whitney U test for the comparison between LFC and AN-LFC. Results: Limbal fibroblasts express barely detectable amounts of PAX6 (LFC: Ctmean=31.58 / AN-LFC: Ctmean=32.85) and treatment with conditioned medium did not lead to a significant increase in PAX6 gene expression. No significant differences in gene expression of COL1A1, COL4A1, HAS2, MMP2, MMP9, TIMP1, HGF, TGF-β1 and NFkB were found between the LFC and AN-LFC populations. Incubation with pLEC-CM led to a significant upregulation of gene expression of COL4A1 (p=0.008) and MMP2 (p=0.01) in AN-LFC. Prior to contact with the limbal fibroblasts, the protein concentration of MMP9 was considerably higher in the pLEC-CM (1120 pg/ml) than in the mut-LSC-CM (162 pg/ml). Compared to the corresponding LFC group, a reduced gene expression of ACTA2 (p=0.03) was measured in the AN-LFC with pLEC-CM. Incubation with pLEC-CM led to a significant upregulation of gene (p=0.002) and protein expression (p<0.0001) of IL6 in the LFC group. In contrast, the AN-LFC with mut-LSC-CM showed no significant change in gene or protein expression of IL6. Similarly, there was a significant increase in CCL2 gene expression in the LFC group with pLEC-CM (p=0.001), but 6 no change in the AN-LFC group with mut-LSC-CM. The protein expression of VEGFA was significantly reduced in the AN-LFC population with pLEC-CM compared to the corresponding LFC group (p=0.02). Conclusion: In the context of congenital aniridia, PAX6 haploinsufficiency has an impact on the cell physiology of limbal fibroblasts despite the already low levels of PAX6 expression, which were particularly noticeable in the expression of IL6, ACTA2 and VEGFA. With control medium, the AN-LFC did not exhibit a dysregulation of the investigated biomarkers of the extracellular matrix (COL1A1, COL4A1, HAS2, MMP2, MMP9, TIMP1, HGF and TGF-β1) at the transcriptional level after 48 hours, so that the histopathological changes in the AAK could be the result of a metabolically stimulated state, such as in a persistent inflammatory environment. The reduced gene expression of ACTA2 could indicate a faster metabolization rate of profibrotic molecules by the AN-LFC. Furthermore, a different response of the limbal fibroblasts to their associated conditioned medium (LFC with pLEC-CM and AN-LFC with mut-LSC-CM) after 48 hours is evident, which may indicate a disturbed interaction between the epithelial cells and their niche cells.