Etablierung und Charakterisierung muriner KRAS-getriebener Lungentumor-Organoide

Abstract

Lungenkrebs ist diejenige Krebserkrankung, welche die weltweit höchste Anzahl an krebsbedingten Todesfällen zu verantworten hat. Der Grundlagenforschung von Lungenkrebs kommt somit weiterhin eine große Wichtigkeit zu, um die Entstehung dieser malignen Neoplasie besser zu verstehen und zielgerichtete Therapien daraus ableiten zu können. Dabei bleibt der Einsatz von Tierversuchen eine oft unverzichtbare Notwendigkeit. Dieser sollte jedoch im Sinne des Tierschutzes auf ein minimales und ethisch vertretbares Niveau reduziert werden. Ein wichtiger Aspekt zur Erreichung dieses Ziels stellt die Modellierung von Krebsgewebe durch eine Zellkultur dar, wobei hierzu eine möglichst getreue Repräsentation der krebseigenen Gewebearchitektur und -eigenschaften benötigt wird. Organoide sind dreidimensionale Zellkulturmodelle, welche diesem Profil deutlich mehr entsprechen als vergleichbare 2D-Zellkulturen. Lungentumororganoiden wird dabei ein großes Potenzial bezüglich des Einsatzes in der Wirkstoffforschung und der Präzisionsmedizin, aber auch der Grundlagenforschung, zugeschrieben. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein niederschwellig durchführbares Protokoll zu etablieren, welches die dreidimensionale Kultivierung von KRAS-getriebenen murinen Lungentumororganoiden ermöglicht, um ein Modell eines im Frühstadium befindlichen Lungenadenokarzinoms zu bieten. Hierzu wurden Tumorknoten aus den Lungen von C57BL/6N KrasLA1-Mäusen herauspräpariert, in Einzelzellen dissoziiert und in einem Matrigel-haltigen Kulturmedium in Transwell-Membraneinlagen ausgebracht. Die gewachsenen Organoide wurden über einen maximalen Zeitraum von 30 Tagen kultiviert, anschließend in Paraffin eingebettet, zu histologischen Schnitten verarbeitet und durch immunhistochemische Färbungen charakterisiert. Mit dem Vorhaben der Etablierung einer Negativkontrolle wurde das identische Versuchsprotokoll mit dissoziiertem Lungenparenchym von Wildtyp-Mäusen unter identischen Kulturbedingungen durchgeführt, um eine Verunreinigungssituation durch physiologische Lungenzellen abzubilden. Die hierbei gewachsenen Organoide durchliefen ebenfalls einen 30-tägigen Kultivierungsprozess und eine immunhistochemische Charakterisierung. Die aus dissoziiertem Lungentumorgewebe der Kras-Mäuse kultivierten Organoide zeigten sich in der immunhistochemischen Charakterisierung identisch zum Primärtumor positiv für den Alveolarepithelzell-Typ-II-Marker SFTPC, negativ für den Keulenzellmarker SCGB1A1 und negativ für den Basalzellmarker KRT5. Die aus Lungenparenchym der Wildtyp-Mäuse kultivierten Organoide zeigten sich hingegen SFTPC-negativ, SCGB1A1-positiv und KRT5-negativ. Die vergleichende Gegenüberstellung der Tumor- und Lungenorganoide zeigte ebenfalls signifikante Unterschiede im Wachstumsverhalten, der Proliferationsrate sowie im Bereich der zytologischen Merkmale. Beide Organoid-Typen konnten unter Beibehaltung der immunhistochemischen Charakterisierungsmarker passagiert und damit expandiert werden. Aus der Co-Kultivierung der Tumororganoide mit Alveolarmakrophagen resultierte ein größerer Ertrag an Organoiden. Mit dieser Arbeit gelang die Etablierung eines niederschwellig durchzuführenden Protokolls, um passagierbare, murine, KRAS-getriebene Lungenadenokarzinomzellen in Form einer dreidimensionalen Zellkultur zu kultivieren. Diese Lungentumororganoide konnten immunhistochemisch charakterisiert werden, wurden in Ihrem Wachstumsverhalten vermessen und dienen der Modellierung eines im Frühstadium befindlichen Lungenadenokarzinoms. Weiterhin gelang die Abgrenzung zu aus Lungenparenchym von Wildtyp-Mäusen identisch kultivierten Lungenorganoiden. Diese konnten immunhistochemisch als Keulenzellorganoide identifiziert werden. Beide in dieser Arbeit etablierten Organoidtypen, Tumororganoide und Lungenorganoide, bieten reduktionistische und expandierbare Modelle zur Erforschung des Lungenadenokarzinoms sowie der heterogenen Keulenzellpopulation und leisten damit einen Beitrag zur Reduktion von Tierversuchen.

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Basic research into lung cancer is therefore still of great importance in order to better understand the development of this malignant neoplasm and to be able to derive targeted therapies. The use of animal experiments remains an often indispensable necessity. However, in the interest of animal welfare, this should be reduced to a minimal and ethically acceptable level. An important aspect of achieving this goal is the modelling of cancer tissue in cell culture. This requires the most faithful possible representation of the cancer's own tissue architecture and properties. Organoids are three-dimensional cell culture models that are much closer to this profile than comparable 2D cell cultures. Lung tumor organoids are considered to have great potential for use in drug discovery and precision medicine, as well as in basic research. The aim of this work was to establish a low-threshold protocol that allows the three-dimensional cultivation of KRAS-driven murine lung tumor organoids to provide a model of early-stage lung adenocarcinoma. Tumor nodules were dissected from the lungs of C57BL/6N KrasLA1 mice, dissociated into single cells and plated in Matrigel-containing culture medium in Transwell membrane inserts. The grown organoids were cultured for a maximum of 30 days, then embedded in paraffin, processed for histological sections and characterised by immunohistochemical staining. To provide a negative control, the same experimental protocol was performed with dissociated lung parenchyma from wild-type mice under identical culture conditions to simulate contamination by physiological lung cells. These organoids were also cultured for 30 days and immunohistochemically characterised. The organoids cultured from dissociated Kras lung tumor tissue were positive for the alveolar epithelial cell type 2 marker SFTPC, negative for the club cell marker SCGB1A1 and negative for the basal cell marker KRT5 in immunohistochemical characterization, identical to the primary tumor. In contrast, organoids grown from the lung parenchyma of wild-type mice were SFTPC negative, SCGB1A1 positive and KRT5 negative. Comparison of tumor and lung organoids showed significant differences in growth behaviour, proliferation rate and cytological characteristics. Both types of organoids could be passaged and expanded while retaining their immunohistochemical characterisation markers. Co-cultivation of tumor organoids with alveolar macrophages resulted in a higher yield of organoids. With this work, a low-threshold protocol was established to cultivate passageable, murine, KRAS-driven lung adenocarcinoma cells in the form of a three-dimensional cell culture. These lung tumor organoids could be characterised immunohistochemically, their growth behaviour was measured and they are used to model an early stage lung adenocarcinoma. They could also be distinguished from lung organoids grown in the same way from the lung parenchyma of wild-type mice. These were identified by immunohistochemistry as club cell organoids. Both types of organoids established in this work, tumor and lung organoids, provide reductionist and expandable models for the study of lung adenocarcinoma and the heterogeneous club cell population, thus contributing to the reduction of animal experimentation.