Selektion und Charakterisierung eines HLA-C*07:02 restringierten, CMV-spezifischen Antikörpers mittels Phagen-Display

Abstract

Eine Zytomegalievirus (CMV)-Reaktivierung zählt zu den häufigsten Komplikationen bei Menschen nach allogener Stammzelltransplantation (HSCT) oder solider Organtransplantation (SOT). Trotz antiviraler Prophylaxe ist die CMV-Reaktivierung immer noch mit einer deutlich erhöhten Morbidi-tät und Mortalität bei Transplantationspatienten vergesellschaftet. Bei Gesunden wird die Infektion durch T-Zellen kontrolliert, bei Immunsupprimierten ist die T-Zellantwort für eine CMV-Kontrolle nicht mehr ausreichend. Die T-Zell-abhängige Immunantwort stützt sich auf die intrazelluläre Prozessierung und Präsentati-on von Viruspeptiden durch MHC-Klasse-Ⅰ-Moleküle der virusbefallenen Zellen. MHC-Klasse-Ⅰ-Moleküle werden durch die drei Gene HLA-A, HLA-B und HLA-C kodiert. T-Zellen erkennen mit ihrem T-Zell Rezeptor (TCR) den MHC/Peptid-Komplex, der von den infizierten Zel-len präsentiert wird. Aktuelle Studien konnten zeigen, dass HLA-C*07:02 kodierte MHC-Ⅰ-Rezeptoren kaum von immunevasiven Mechanismen des CMV betroffen sind. TRC-like Antikörper können, im Gegensatz zu herkömmlichen Antikörpern, ähnlich dem TCR der T- Zellen den MHC/Peptid-Komplex binden und bieten sich daher als mögliche Therapieoption in Situationen mit T-Zell Defekt an. Mit Hilfe der Phagen-Display-Methode haben wir HLA-C*07:02 restringierte, CMV-spezifische An-tikörper identifiziert. Hierzu wurden zunächst HLA-C*07:02 Komplexe synthetisiert, um diese mit dem CMV-Peptid CRVLCCYVL zu beladen. Durch Inkubation von Fab-Antikörper-präsentierenden Phagen mit diesen MHC-Ⅰ-Komplexen konn-ten mehrere HLA-C*07:02/CMV-Peptid-bindende Antikörperfragmente (Fab) identifiziert werden. Eine weitere Selektion der Phagen erfolgte an biotinylierten HLA-C*07:02/CRVLCCYVL Komple-xen. TG1 E. coli Bakterien wurden mit den selektierten Phagen infiziert und lösliche Fab produziert. Die Bindungsfähigkeit der Fab wurde an HLA-C*07:02-exprimierenden, lymphoblastoiden Zelllinien (LCL), die mit dem CMV-Peptid beladen wurden, getestet. Die Fab zeigten keine Bindung an mit einem Kontrollpeptid beladene HLA-C*07:02-Komplexe, sowie an andere getestete HLA-C Allele. Insgesamt konnten drei Fab-Klone mit spezifischer Bindungsfähigkeit gegenüber den HLA-C*07:02/CRVLCCYVL Komplexen identifiziert werden.

A Cytomegalovirus (CMV) reactivation in humans after allogeneic stem cell transplantation (HSCT) or solid organ transplantation (SOT) is one of the most common complications. Despite antiviral prophylaxis, CMV reactivation is still associated with significantly increased morbidity and mortality in transplant patients. In healthy individuals, infection is controlled by T-cells, while in immuno-suppressed individuals the T-cell response is no longer adequate. The T-cell immune response depends on the intracellular processing and presentation of viral pep-tides by MHC-class-Ⅰ-molecules of virus-infected cells. The MHC-class-Ⅰ-molecules are encoded by the three genes HLA-A, HLA-B and HLA-C. T-cells recognize the MHC/CMV-peptide complex presented by infected cells with their T-cell receptor (TCR). Recent studies have shown that HLA-C*07:02-encoded MHC-Ⅰ receptors are hardly affected by the immune evasion mechanisms of CMV. TRC-like antibodies, in contrast to conventional antibodies, can bind the MHC/peptide complex similar to the TCR of T-cells and therefore offer a potential therapeutic option for patients with T-cell defects. Using the phage display method, we identified HLA-C*07:02 restricted CMV-specific antibodies. For this purpose, we first synthesized HLA-C C*07:02 receptors to load them with the CMV peptide CRVLCCYVL. By incubating phages with these MHC-Ⅰ/peptide-complexes, several specific Fab-antibody presenting phages were identified. To ensure a binding ability, phages were further selected on biotinylated HLA-C*07:02/CRVLCCYVL complexes. TG1 E. coli bacteria were infected with the selected phages and soluble Fab were produced. The binding of the Fab was tested on HLA-C*07:02 expressing lymphoblastoid cell lines (LCL) loaded with the CMV peptide. Selected Fab showed no binding to control peptide-loaded HLA-C*07:02 receptors, as well as to LCLs expressing MHC complexes of different HLA-C alleles. In total, three Fab clones were identified that showed specific binding to the HLA-C*07:02/CRVLCCYVL complex.