Die intra-tumorale Heterogenität spezifischer Gen-Promotor-Methylierungen im Glioblastoma multiforme

Abstract

Die intra-tumorale Heterogenität spezifischer Gen-Promotor-Methylierungen im Glioblastoma multiforme Das Glioblastom ist der häufigste und zugleich bösartigste hirneigene Tumor des Erwachsenen. Trotz multimodaler Therapieansätze ist die Prognose schlecht. Wie bereits der Name Glioblastoma multiforme erahnen lässt zeichnet sich der Tumor durch ein, auf vielen Ebenen, unterschiedliches Erscheinungsbild aus. Zunehmend rücken molekulare Tumorcharakteristika in den Fokus der pathologischen Diagnostik. Dies betrifft beim Glioblastom unter anderem auch epigenetische Tumormerkmale. Insbesondere sind hier Methylierungsvorgänge in der Promoter Region von DNA-Reparaturgenen oder Tumorsupressorgenen wie beispielsweise MGMT, p15 und p16 zu nennen, worauf sich auch die vorliegende Arbeit konzentriert. Das DNA-Reparaturgen MGMT ist von entscheidender Bedeutung, da sich der therapeutische Ansatz an der Methylierung des Promotors dieses Gens orientiert. Die Tumorsuppressorgene p15 und p16 haben einen Einfluss auf die Regulation des Zellzyklus und können bei Malfunktion das Tumorwachstum begünstigen. In der klinischen Praxis erfolgt eine entsprechende Charakterisierung üblicherweise aus einer einzelnen Probe, deren Eigenschafen dann auf den gesamten Tumor generalisiert werden. Inwieweit dies der biologischen Realität entspricht oder ob eine intratumorale Heterogenität auf epigenetischer Ebene existiert ist von hohem klinischem Interesse. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher zu beantworten, inwieweit eine intra-tumorale Heterogenität im Hinblick auf die Methylierungsloci MGMT, p15 und p16 vorliegt. Darüber hinaus sollte geklärt werden, ob der Ausprägungsgrad der Heterogenität mit dem Überleben korreliert. Hierfür wurden insgesamt 154 Patienten mit neu diagnostiziertem Glioblastom in die Studie eingeschlossen. Davon dienten 120 Patienten als Referenzkollektiv, hier wurde pro Patienten eine Probe aus dem Tumor entnommen. Weitere 34 Patienten bildeten das Testkollektiv, hier wurden drei Proben aus unterschiedlichen Lokalisationen des Tumors, insgesamt also 102 Tumorproben, gewonnen. Die MGMT-, p15- und p16-Promotor-Methylierungen wurden in allen Tumorproben mittels methylierungsspezifischer PCR gemessen. Im nächsten Schritt wurde aus dem Referenzkollektiv eine Referenzgruppe gebildet, indem zufällig drei Patienten zu einem Triplet, insgesamt also 40 Triplets, zusammengefasst wurden. Dem standen 34 Triples des Testkollektivs – nun Testgruppe- gegenüber. Dieses Studiendesi erlaubt einen Vergleich der intra-tumoralen Heterogenität (Testgruppe) mit der inter-tumoralen Heterogenität (Referenzgruppe) als Baseline. Eine Homogenität der Methylierung wurde definiert, wenn alle drei Proben eines Triplets den gleichen Methylierungsstatus aufwiesen, entweder methyliert oder nicht-methyliert. Im Falle einer Abweichung innerhalb eines Triplets wurde eine Heterogenität angenommen. Zusammenfassend konnte eine Heterogenität aller drei Methylieurngsloci in der Testgruppe – also innerhalb eines Tumors – nachgewiesen werden. Das Auftreten einer Heterogenität innerhalb eines Tumors lag für MGMT, p15 und p16 bei jeweils 52,9%, 35,3% und 44,1%. Eine Heterogenität der MGMT-Methylierung war in der Testgruppe (intra-tumoral) signifikant geringer als in der Referenzgruppe (inter-tumoral). Kein signifikanter Unterschied bestand in der Heterogenität der p15- und p16-Methylierung zwischen der Test- und Referenzgruppe. Ein signifikanter Einfluss der oben beschriebenen Heterogenität in Hinblick auf das progressionsfreie und das Gesamtüberleben konnte für keinen Methylierungslocus nachgewiesen werden. Es kann festgehalten werden, dass eine intratumorale Heterogenität in Hinblick auf die Methylierung von MGMT, p15 und p16 existiert und gegebenenfalls sogar das Ausmaß der inter-tumoralen Heterogenität erreicht. Inwieweit auch ein Einfluss auf das Überleben besteht, kann aufgrund der vorliegenden Fallzahlen nicht abschließend beurteilt werden. Die molekulare epigenetische Charakterisierung anhand einer Probe scheint zumindest beim Glioblastom die biologische Realität nur eingeschränkt wiederzugeben

Intratumoral Heterogeneity of Specific Gene Promoter Methylations in Glioblastoma Multiforme Glioblastoma is the most common and at the same time the most malignant brain tumor in adults. Despite multimodal therapeutic approaches, the prognosis remains poor. As the name Glioblastoma multiforme suggests, the tumor is characterized by a highly variable appearance on many levels. Molecular tumor characteristics are increasingly becoming the focus of pathological diagnostics. This includes epigenetic features of glioblastoma, among which methylation processes in the promoter region of repair genes or tumor suppressor genes such as MGMT, p15, and p16 are particularly noteworthy, and are also the focus of this present work. The repair gene MGMT is of crucial importance, as the therapeutic approach is guided by its promoter DNA methylation. The tumor suppressor genes p15 and p16, on the other hand, influence cell cycle regulation and can promote tumor growth when their function is disrupted. In clinical practice, such characterization typically comes from a single sample, whose properties are then generalized to the entire tumor. Whether this corresponds to biological reality or whether intra-tumoral heterogeneity also exists at an epigenetic level is of high clinical interest. Therefore, the aim of this study was to determine the extent of intra-tumoral heterogeneity with respect to methylation loci MGMT, p15, and p16. Furthermore, the aim was to clarify whether the degree of heterogeneity possibly correlates with survival. For this purpose, a total of 154 patients with newly diagnosed glioblastoma were included in the study. Of these, 120 patients served as a reference cohort; here one sample per patient was taken. An additional 34 patients formed the test cohort; from these patients three samples from different locations within the tumor were taken, resulting in a total of 102 tumor samples. The MGMT, p15, and p16 promoter methylations were measured in all tumor samples using methylation-specific PCR. In the next step, a reference group was formed from the reference cohort by randomly combining three patients into a triplet – resulting in a total of 40 triplets. This was compared to 34 triplets from the test cohort – now called test group. This study design allows for comparison between intra-tumoral heterogeneity (test group) and inter-tumoral heterogeneity (reference group) as a baseline. Homogeneity in methylation was defined when all three samples of a triplet showed the same methylation status, either methylated or unmethylated. If there was a deviation within a triplet, heterogeneity was assumed. In summary, heterogeneity of all three methylation loci could be demonstrated within tumors in the test group. The occurrence of heterogeneity within a tumor for MGMT, p15, and p16 was 52.9%, 35.3%, and 44.1%, respectively. Heterogeneity of MGMT methylation was significantly lower in the test group (intra-tumoral) than in the reference group (inter-tumoral). There was no significant difference in heterogeneity for p15 and p16 methylation between test and reference groups. A significant influence of the described heterogeneity on progression-free survival or overall survival could not be demonstrated for any methylation locus. It can be concluded that intra-tumoral heterogeneity regarding methylation of MGMT, p15 and p16 exists and may even reach the extent of inter-tumoral heterogeneity. Whether there is also an impact on survival cannot be conclusively assessed based on current case numbers. Molecular epigenetic characterization based on a single sample seems to reflect biological reality only to a limited extent in glioblastoma at least.