Effect of cell maturation and cytokine inhibition on the cytotoxic arsenal release by CD8+ T cells

Abstract

Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) play a pivotal role in the eradication of infected and malignant cells through the release of cytotoxic molecules, including perforin (Prf) and granzyme B (GzmB). These molecules are stored in specialized granules. Two classes of granules were identified by Bálint et al. (2020) and Chang et al. (2022), single-core granules (SCGs) and multi-core granules (MCGs). It is noteworthy that MCGs discharge their toxic cargo in the form of supramolecular attack particles (SMAPs) into the immunological synapse (IS), thereby ensuring precise and efficient destruction of the target cell. In order to explore the factors that induce T cell cytotoxicity, we employed both wild-type and GzmB-tdTomato knock-in mice, in addition to fluorescently labeled thrombospondin-1 (TSP-1) as markers for MCGs. By employing flow cytometry and advanced imaging techniques, namely Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM), Structured Illumination Microscopy (SIM), and Transmission Electron Microscopy (TEM), we were able to ascertain that prolonged culture time led to increased biogenesis and release of CGs without any alteration to the T cell subtypes. The exogenous labeling with Wheat germ agglutinin (WGA) revealed the existence of a potential intermediate CG, which may serve as a step in MCGs maturation. This novel class is capable of releasing cytotoxic substances in the IS, in a similar manner to that observed with SCGs. Furthermore, we discovered that stimulation of T cells at an earlier stage of culture boosts the maturation of T cells through the generation of more MCGs and SMAPs. Given the essential role of cytokines in T-cell activation, we conducted further research to ascertain whether these cytokines could influence the generation of MCGs and additionally SMAPs. To this end, we employed Cyclosporin A (CsA), a well-characterized immunosuppressant, to elucidate the contribution of diverse cytokines to MCG release. In particular, we demonstrated that Interferon-gamma (IFN-γ), a crucial cytotoxic cytokine, markedly affected MCG release. This conclusion was corroborated through the utilization of anti-IFN-γ antibody. My work revealed two unidentified factors (time in culture and the concentration of IFN-γ) that modify the generation and the subsequent release of MCGs and SMAPs formation. These findings have the potential to facilitate the development of novel immunotherapeutic strategies, providing new avenues for the enhancement of T cell-mediated cancer and infection therapies.

Zusammenfassung : Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) spielen durch die Freisetzung zytotoxischer Moleküle, darunter Perforin (Prf) und Granzyme B (GzmB), eine zentrale Rolle bei der Vernichtung infizierter und bösartiger Zellen. Diese Moleküle werden in spezialisierten Granula gespeichert. Bálint et al. (2020) und Chang et al. (2022) haben zwei Klassen von Granula identifiziert: einkernige Granula (SCGs) und mehrkernige Granula (MCGs). Bemerkenswert ist, dass MCGs ihre toxische Fracht in Form von supramolekularen Angriffspartikeln (SMAPs) in die immunologische Synapse (IS) entladen und damit eine präzise und effiziente Zerstörung der Zielzelle gewährleisten. Um die Faktoren zu erforschen, die die Zytotoxizität der T-Zellen auslösen, setzten wir sowohl Wildtyp- als auch GzmB-tdTomato-Knock-in-Mäuse ein, zusätzlich zu fluoreszierend markiertem Thrombospondin-1 (TSP-1) als Marker für MCGs. Durch den Einsatz von Durchflusszytometrie und fortschrittlichen bildgebenden Verfahren, nämlich Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM), Structured Illumination Microscopy (SIM) und Transmission Electron Microscopy (TEM), konnten wir feststellen, dass längere Kulturzeiten zu einer erhöhten Biogenese und Freisetzung von CGs führte, ohne dass die T-Zell-Subtypen verändert wurden. Die exogene Markierung mit Weizenkeim-Agglutinin (WGA) zeigte die Existenz eines potenziellen Zwischenprodukts CG, das möglicherweise als Vorreifungsschritt von MCGs dient. Diese neue Klasse ist in der Lage, im IS zytotoxische Substanzen freizusetzen, ähnlich wie dies bei SCGs beobachtet wurde. Darüber hinaus entdeckten wir, dass die Stimulation von T-Zellen in einem früheren Stadium der Kultur die Reifung der T-Zellen fördert, so dass sie durch die Bildung von mehr MCGs und SMAPs. Angesichts der wesentlichen Rolle von Zytokinen bei der T-Zell-Aktivierung führten wir weitere Untersuchungen durch, um festzustellen, ob diese die Bildung von MCGs und zusätzlich SMAPs beeinflussen könnten. Zu diesem Zweck setzten wir Cyclosporin A (CsA), ein gut charakterisiertes Immunsuppressivum, ein, um den Beitrag verschiedener Zytokine zur MCG-Freisetzung zu untersuchen. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass Interferon-gamma (IFN-γ), ein wichtiges zytotoxisches Zytokin, die MCG-Freisetzung deutlich beeinflusst. Diese Schlussfolgerung wurde durch die Verwendung von anti-IFN-γ-antikörpern bestätigt. Meine Arbeit ergab, dass zwei bisher unbekannte Faktoren (die Zeit in der Kultur und die IFN-γ-Konzentration) die Bildung und anschließende Freisetzung von MCGs und die SMAP-Bildung beeinflussen. Diese Erkenntnisse haben das Potenzial, die Entwicklung neuartiger immuntherapeutischer Strategien zu erleichtern und neue Wege für die Verbesserung von T-Zell-vermittelten Krebs- und Infektionstherapi.