Auswirkung von Dialyseserum auf die Fibrosemarker TGF-ß und CTGF in Kardiomyozyten und kardialen Fibroblasten

Abstract

Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CNI) zeigen ein erhöhtes kardiovaskuläres Risiko [131], unter anderem durch die Entwicklung einer Myokardialen Fibrosierung [65]. Führt eine bestehende Niereninsuffizienz direkt oder indirekt zu einer Herzerkrankung, so spricht man von einem renokardialen Syndrom [81]. Vorhofflimmern stellt die häufigste Arrhythmie bei CNI dar [28]. Gleichzeitig führt Vorhofflimmern per se zu einer atrialen Herzfibrosierung [140]. Myokardiale Fibrose kann neben Arrhythmien [7,18,87], auch zu einer Herzinsuffizienz führen [87]. Das Urämietoxin Indoxylsulfat (IS) wurde als mögliches Bindeglied in der renokardialen Verbindung vorgeschlagen [53], da IS eine pro-fibrotische Wirkung auf das Herz gezeigt hat [75,118]. Inwieweit Urämitoxine die Entstehung von Vorhofflimmern bei CNI begünstigt, ist jedoch nur unzureichend untersucht. Ziele dieser Arbeit waren es, die Auswirkungen von Dialyseseren auf die Expression des Fibrosemarkers Transforming Growth Factor beta (TGF-ß), des Connective Tissue growth Factors (CTGF), sowie auf die Kollagen 1A1 (Col1A1) und 3A1 (Col3A1) Expression in Kardiomyozyten und kardialen Fibroblasten zu untersuchen. Mittels in vitro Zellkulturexperimenten wurden neonatale Kardiomyozyten und kardialen Fibroblasten der Ratten für 24 Stunden mit humanem gesunden- und Dialyseseren behandelt. Die Inkubation der kardialen Fibroblasten mit Dialyseserum führte zu einer zunehmenden Proteinexpression von CTGF um 39,8±11,3% (p=0,008), von Col1A1 um 112,9±22,6% (p<0,001) und von Col3A1 um 105,2±22% (p<0,001) im Vergleich zu gesundem Serum. Für den Fibrosemarker TGF-ß konnte keine Veränderung der Proteinexpression der kardialen Fibroblasten festgestellt werden. In isolierten neonatalen Kardiomyozyten bewirkte eine Behandlung mit Dialyseserum im Vergleich zu gesundem Serum eine TGF-ß-Protein Expressionszunahme um 105,2±22% (p<0,001) und eine CTGF-Protein Expressionszunahme um 526,6±194% (p=0,05). Neben der Aktivierung der pro-fibrotischen Signalkaskade durch die Dialyseserumbehandlung, konnte zudem eine 1,8-fach erhöhte Genexpression des Hypertrophiemarkers BNP (p=0,001) gezeigt werden. Auch für den Ryanoid Rezeptor 2 (RyR2) konnte bei Behandlung mit Dialyseserum eine Expressionszunahme um 1,7±0,3 (p<0,001) nachgewiesen werden. Neonatale Kardiomyozyten zeigten sich zudem responsiv auf eine Stimulation mit 100µmol/L Indoxylsulfat. Dabei induzierte IS nach 24-stündiger Inkubation eine Zunahme der TGF-ß Proteinexpression um 65,9±19,6% (p=0,03) im Vergleich zu unbehandelten Kardiomyozyten. Dieser Effekt konnte in kardialen Fibroblasten nicht beobachtet werden. Um im Zellkulturmodell die Auswirkungen von Vorhofflimmern (VHF) und CNI in Kombination auf die kardiale Fibrose zu untersuchen, wurden diese beiden Komorbiditäten kombiniert. Hierzu wurden neonatale Ratten-Kardiomyozyten in Dialyseserum inkubiert und gleichzeitig wurde Vorhofflimmern simuliert, indem die Kardiomyozyten mit Hilfe von Elektroden arrhythmisch stimuliert wurden. Als Kontrolle dienten Kardiomyozyten, welche in gesundes Serum (Kontrollserum) inkubiert und rhythmisch stimuliert wurden. Die Kombination aus arrhythmischer Stimulation und Behandlung mit Dialyseseren für 24h, führte in Kardiomyozyten zu einer Zunahme von TGF-ß um 185,1±43,2% (p=0,002 gegen rhythmische Stimulation und Behandlung mit gesundem Serum). Um die Auswirkungen von VHF und CNI auf neonatale kardiale Fibroblasten im Zellkulturmodell zu untersuchen, wurden zunächst Kardiomyozyten für 24 Stunden mit Dialyseserum behandelt und arrhythmisch stimuliert. Nach 24-stündiger Behandlung wurde das Medium genutzt, um damit kardiale Fibroblasten zu behandeln. Nach 24 Stunden konnte eine Zunahme der TGF-ß Proteinexpression um 436,4±82,8% (p<0,001 gegen die Behandlung mit rhythmisch stimuliertem gesundem Serum) und für die Kollagen-Expression um 164,1±33,4 (p<0,001 gegen die Behandlung mit rhythmisch stimuliertem gesundem Serum) beobachtet werden. Zusammenfassend führt Dialyseserum in Kardiomyozyten zu einer zunehmenden Expression der Fibrosemarker CTGF und TGF-ß, was mutmaßlich in kardialen Fibroblasten eine vermehrte Kollagenexpression induziert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass pro-fibrotischen Wirkungen von Dialyseseren, noch stärker ausgeprägt sind, wenn diese mit arrhythmischer Stimulation kombiniert werden.

An elevated cardiovascular risk is observed in patients with chronic kidney disease (CKD) [131], which is partly attributed to the occurrence of myocardial fibrosis [65]. If pre-existing kidney dysfunction leads directly or indirectly to cardiac disease, this is referred to as the cardiorenal syndrome [81]. Atrial fibrillation (AF) is the most common arrhythmia observed in CKD [28] and, in turn, AF itself promotes atrial cardiac fibrosis [140]. Myocardial fibrosis can lead not only to arrhythmias [7,18,87] but also to heart failure [87]. The uremic toxin indoxyl sulfate (IS) has been proposed as a potential link in the cardiorenal connection [53], as IS has been shown to exert pro-fibrotic effects on the heart [75,118]. However, the extent to which uremic toxins contribute to the development of atrial fibrillation in CKD remains insufficiently investigated. The aim of this study was to investigate the effects of dialysis serum on the expression of the fibrosis marker transforming growth factor beta (TGF-β), connective tissue growth factor (CTGF), as well as collagen 1A1 (Col1A1) and 3A1 (Col3A1) in cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. In vitro cell culture experiments were conducted using neonatal rat cardiomyocytes and cardiac fibroblasts treated for 24 hours with either healthy human serum or dialysis serum. Incubation of cardiac fibroblasts with dialysis serum led to a significant increase in CTGF protein expression by 39.8±11.3% (p=0.008), Col1A1 by 112.9±22.6% (p<0.001), and Col3A1 by 105.2±22% (p<0.001), compared to treatment with healthy serum. No changes were observed in TGF-β protein expression in cardiac fibroblasts. In isolated neonatal cardiomyocytes, treatment with dialysis serum resulted in a TGF-β protein expression increase of 105.2±22% (p<0.001) and CTGF protein expression increase of 526.6±194% (p=0.05), compared to healthy serum. Beyond activation of pro-fibrotic signaling pathways, dialysis serum also induced a 1.8-fold increase in the gene expression of the hypertrophy marker BNP (p=0.001). Furthermore, expression of the ryanodine receptor 2 (RyR2) was significantly upregulated by 1.7±0.3-fold (p<0.001). Neonatal cardiomyocytes also responded to stimulation with 100 µmol/L indoxyl sulfate. After 24 hours of incubation, IS induced an increase in TGF-β protein expression by 65.9±19.6% (p=0.03) compared to untreated cardiomyocytes. This effect was not observed in cardiac fibroblasts. To investigate the combined effects of atrial fibrillation (AF) and CKD on cardiac fibrosis in a cell culture model, both comorbidities were simulated. Neonatal rat cardiomyocytes were incubated with dialysis serum and simultaneously exposed to arrhythmic stimulation using electrodes to simulate AF. As a control, cardiomyocytes were treated with healthy serum and stimulated rhythmically. The combination of arrhythmic stimulation and dialysis serum treatment for 24 hours resulted in a TGF-β expression increase of 185.1±43.2% (p=0.002 vs. rhythmic stimulation and healthy serum treatment). To examine the impact of AF and CKD on neonatal cardiac fibroblasts in this model, cardiomyocytes were first treated for 24 hours with dialysis serum and arrhythmic stimulation. The conditioned medium was then used to treat cardiac fibroblasts. After another 24 hours, a significant increase in TGF-β protein expression by 436.4±82.8% (p<0.001 vs. treatment with rhythmically stimulated healthy serum) and collagen expression by 164.1±33.4% (p<0.001) was observed. In summary, dialysis serum induces increased expression of the fibrosis markers CTGF and TGF-β in cardiomyocytes, which likely stimulates enhanced collagen expression in cardiac fibroblasts. This study demonstrates that the pro-fibrotic effects of dialysis serum are further amplified when combined with arrhythmic stimulation.