T-zelluläre Charakteristika von Personen mit Melanom oder Nierenzellkarzinom unter Immun-Checkpoint-Inhibitor Therapie und von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten bei Personen mit Nierenzellkarzinom

Abstract

Zwei der häufigsten Tumore in Deutschland sind das Melanom auf Platz fünf und das Nierenzellkarzinom auf Platz zehn der Krebserkrankungen bei beiden Geschlechtern. Nicht nur in der Entstehung von Tumoren, sondern auch in deren Therapie spielt die zelluläre Immunantwort eine große Rolle. Im vergangenen Jahrzehnt haben sich die Therapieoptionen insbesondere für das Melanom gebessert und es stehen mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren wie PD-1 sowie CTLA-4 Inhibitoren potente Systemtherapeutika zur Verfügung, welche nicht nur im metastasierten Stadium, sondern auch in der adjuvanten Therapie in niedrigeren Stadien Einzug gehalten haben. Auch für das Nierenzellkarzinom im metastasierten Stadium haben sich die Immun-Checkpoint-Inhibitoren etabliert, da konventionelle Chemotherapeutika aufgrund der Tumorbiologie wenig wirksam sind. Die Immun-Checkpoint-Inhibitoren zielen auf die T-zelluläre Immunantwort ab und führen zu einer Enthemmung des Immunsystems und reaktivierter, antitumorösen Immunaktivität. Diese Arbeit hatte zum Ziel das Immunsystem der Personen mit Melanom oder Nierenzellkarzinom mit einer Immun-Checkpoint-Inhibitor Therapie zu charakterisieren. Es wurden mögliche T-zelluläre Charakteristika und Marker untersucht, welche möglicherweise mit einem Therapieansprechen oder mit dem Auftreten von autoimmunen Nebenwirkungen assoziiert sind. Diese wurden bei Personen mit Melanom im Therapieverlauf untersucht. Des Weiteren wurden bei an einem Nierenzellkarzinom erkrankten Personen Tumor-infiltrierende Lymphozyten mit Lymphozyten aus peripherem Blut verglichen. Neben der quantitativen und qualitativen Analyse der Immunzellen lag ein Schwerpunkt der Arbeit auf der methodischen Weiterentwicklung der Isolationsprotokolle, mit anschließender Stimulation von T-Zellen aus solidem Tumorgewebe. Insgesamt wurden 92 Tumorpatienten sowie 50 gesunde Kontrollpersonen in die Studie eingeschlossen. Die Patientengruppe umfasste 47 Personen mit Melanom, von denen 10 im Verlauf unter Immun-Checkpoint-Inhibitor Therapie untersucht wurden. Zudem wurden 45 Personen mit einem Tumor der Niere eingeschlossen. Von diesen lagen 20 Tumorgewebeproben vor. 11 Personen mit einem Tumor der Niere wurden nachträglich aufgrund der Histologie ausgeschlossen, da bei diesen kein Nierenzellkarzinom vorlag. Somit lagen von 34 Personen mit histologisch bestätigtem Nierenzellkarzinom Proben aus peripherem Blut vor, wobei von 15 dieser Personen auch Tumorgewebe vorlag. Untersuchte Parameter der Immunzellen waren die absoluten und relativen Zellzahlen der Leukozyten, Lymphozyten, T-Zellen, CD8, CD4, und regulatorischer T-Zellen. Zudem erfolgte eine Bestimmung des Differenzierungsstatus durch Analyse von CD45R0 und CD62L, kürzlich proliferierter Zellen mit Ki67, der Immun-Checkpointmoleküle CTLA-4, PD-1 und BTLA, sowie des immunmodulatorischen Funktionsmarkers CD39. Überdies wurde die Funktionalität der Immunzellen in Stimulationsassays durch Induktion der Zytokine Interferon-γ, Tumornekrosefaktor-α und Interleukin-2 überprüft. Bei der Analyse wurden Vergleiche vor und unter Immun-Checkpoint-Inhibitor Therapie, zwischen den Medikamenten, bezüglich des Therapieansprechens und dem Auftreten von autoimmunen Nebenwirkungen durchgeführt. Zudem wurden die Tumor-infiltrierenden Lymphozyten nach mechanischer Isolierung aus Nierenzellkarzinomen mittels zwei verschiedener Stimulationsprotokolle mit Lymphozyten aus peripherem Blut verglichen. Personen mit Melanom oder Nierenzellkarzinom wiesen in allen Subpopulationen eine geringere Anzahl an Lymphozyten auf, während der relative Anteil an regulatorischen T-Zellen bei Personen mit Melanom erhöht war. Zudem war ein erhöhter Anteil an kürzlich proliferierter Ki67+ CD4 und CD8 T-Zellen und regulatorischen T-Zellen sowie CD39+ CD4 T-Zellen und regulatorischen T-Zellen bei Personen mit Melanom gegenüber gesunden Kontrollen nachweisbar. Unter Immun-Checkpoint-Inhibitor -Therapie nahm die absolute Zahl an Leukozyten, Lymphozyten, CD4 und CD8 T-Zellen und regulatorischen T-Zellen signifikant ab. Zudem zeigte sich ein Rückgang der Anteile an PD-1+ CD4 und CD8 T-Zellen sowie regulatorischen T-Zellen. Dahingegen stieg der Anteil an CTLA-4+ CD4 T-Zellen und regulatorischen T-Zellen signifikant. Im Therapieverlauf zeigten sich nur dezente Veränderungen der Zytokinexpression. Personen mit Melanom und Immun-Checkpoint-Inhibitor-Therapieansprechen wiesen gegenüber Personen ohne Immun-Checkpoint-Inhibitor-Therapieansprechen eine signifikant höhere Lymphozytenzahl, geringere PD-1 Expression auf CD4 T-Zellen und regulatorischen T-Zellen, als auch eine erhöhte CTLA-4 Expression auf CD8 T-Zellen nach polyklonaler Stimulation auf. Eine erhöhte CTL-4 Expression als Ausdruck einer aktiven CD8 T-Zellantwort bei Personen mit Melanom unter Immun-Checkpoint-Inhibitor -Therapie wurde auch im Rahmen der autoimmunen Nebenwirkung detektiert. Herausragend zeigte sich bei Personen mit autoimmunen Nebenwirkungen unter Immun-Checkpoint-Inhibitor -Therapie ein signifikant geringerer Anteil an CD39+ Zellen gegenüber Personen ohne Nebenwirkungen, am ehesten als Ausdruck eines aktiven T-Zellphänotyps. Als mögliches Merkmal einer Antigenauseinandersetzung konnte eine markante erhöhte CTLA-4 Expression für CD8, CD4 und regulatorische T-Zellen auch bei Personen mit NZK gegenüber gesunden Kontrollen identifiziert werden. Im soliden Tumor war die Expression von PD-1 auf CD8, CD4 und regulatorischen T-Zellen gegenüber Zellen aus peripherem Blut erhöht, ohne dass jedoch eine Korrelation zu diesen bestand. Überraschend waren hingegen die Ergebnisse zu CD39, für das sich nicht nur eine erhöhte Expression auf CD8, CD4 und regulatorischen T-Zellen der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten, sondern auch eine positive Korrelation für CD39 auf regulatorischen T-Zellen aus solidem Tumor und peripherem Blut zeigte. Insgesamt zeigten sich verschiedene Merkmale bei Personen mit Melanom oder Nierenzellkarzinom, welche vielversprechende Ansätze für weitere Untersuchung hinsichtlich prätherapeutischer Marker zur Prognose, Therapieansprechen und dem Auftreten von autoimmunen Nebenwirkungen in der Zukunft bieten könnten und sollten in größeren Kollektiven untersucht werden. Schlussendlich konnten auch methodische Kriterien für die Isolation, Weiterverarbeitung und Stimulation der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten erarbeitet werden, welche eine gestärkte Basis für weitere Untersuchungen bieten.

In Germany, two of the most common cancer entities affecting both sexes are melanoma, ranked fifth, and renal cell carcinoma, ranked tenth. The cellular immune response plays a major role not only in the development of tumours, but also in their treatment. Over the past decade, treatment options have drastically improved, especially for melanoma. Immune checkpoint inhibitors such as PD-1 and CTLA-4 inhibitors, which have found their way not only into metastatic stages but also into adjuvant therapy in lower stages, are available as potent systemic therapies. As conventional chemotherapeutic agents are not very effective in renal cell carcinoma, due to the biology of the tumours, immune checkpoint inhibitors have also become established. Immune checkpoint inhibitors lead to disinhibition of the T-cell immune response and reconstituted antitumoural activity. The aim of this study was to characterise the immune system of individuals with melanoma or renal cell carcinoma, undergoing immune checkpoint inhibitor therapy. Potential T-cell characteristics and markers that may be associated with a treatment response or the occurrence of autoimmune side effects were investigated. These were evaluated in individuals with melanoma during therapy. Furthermore, tumour-infiltrating lymphocytes were compared with lymphocytes from peripheral blood in individuals with renal cell carcinoma. In addition to the quantitative and qualitative analysis of immune cells, the study focused on the methodological development of isolation protocols, followed by stimulation of T cells from solid tumour tissue. A total of 92 tumour patients and 50 healthy controls were included in this study. The patient group consisted of 47 individuals with melanoma, 10 of whom were followed up and analysed during immune checkpoint inhibitor therapy. 45 individuals with a kidney tumour were included. From those, 20 tumour tissue samples were collected. 11 individuals with a tumour of the kidney were subsequently excluded due to their histopathology, as they did not have renal cell carcinoma. Thus, peripheral blood samples were available from 34 individuals with histologically confirmed renal cell carcinoma, and tumour tissue was also available from 15 of these individuals. The analysed immune cell parameters compromised absolute and relative cell counts of leukocytes, lymphocytes, T cells, CD8, CD4, and regulatory T cells. Moreover, the differentiation status was assessed by evaluating CD45R0 and CD62L, Ki67 for recently proliferated cells, CTLA-4, PD-1 and BTLA as immune checkpoint molecules and CD39 with immunomodulatory function. The T cell functionality was evaluated in stimulation assays encompassing the cytokines interferon-γ, tumour necrosis factor-α and interleukin-2. The analysis included comparisons before and during immune checkpoint inhibitor therapy, between drugs, in terms of response to therapy and the occurrence of autoimmune side effects. Tumour-infiltrating lymphocytes were additionally compared with lymphocytes from peripheral blood using two different stimulation protocols after mechanical isolation from renal cell carcinomas. Individuals with melanoma or renal cell carcinoma had lower lymphocyte counts in all subpopulations, while the relative proportion of regulatory T cells was increased in individuals with melanoma. An increased proportion of recently proliferated Ki67+ CD4 and CD8 T cells and regulatory T cells, as well as CD39+ CD4 T cells and regulatory T cells, was detected in patients with melanoma compared to healthy controls. The absolute number of leukocytes, lymphocytes, CD4 and CD8 T cells, and regulatory T cells decreased significantly under immune checkpoint inhibitor therapy. Furthermore, a decrease in the proportions of PD-1+ CD4 and CD8 T cells and regulatory T cells was detected in patients with melanoma undergoing immune checkpoint inhibitor therapy. In contrast, the proportion of CTLA-4+ CD4 T cells and regulatory T cells increased in this cohort significantly. Regarding cytokine expression, only subtle changes were observed during therapy. Individuals with melanoma who responded to immune checkpoint inhibitor therapy had significantly higher lymphocyte counts, lower PD-1 expression on CD4 T cells and regulatory T cells, and increased CTLA-4 expression on CD8 T cells after polyclonal stimulation compared to those who did not respond to immune checkpoint inhibitor therapy. Higher CTL-4 expression on CD8 T cell in individuals with melanoma with autoimmune side effects due to immune checkpoint inhibitor therapy was also observed. Strikingly patients withs autoimmune side effects under immune checkpoint inhibitor therapy showed a significantly lower proportion of CD39+ CD8, CD4 and regulatory T cells, most likely as an expression of an active T cell phenotype, compared to those without autoimmune side effects. For CD8, CD4 and regulatory T cells an increase in CTLA-4 expression was identified as a possible feature of antigen confrontation, mainly in individuals with renal cell carcinoma compared to healthy controls. The expression of PD-1 on CD8, CD4 and regulatory T cells originating from tumour-infiltrating lymphocytes from renal cell carcinoma was increased compared to cells from peripheral blood, but there was no correlation between the two. Remarkably CD39 showed not only increased expression on CD8, CD4 and regulatory T cells of tumour-infiltrating lymphocytes, but also a positive correlation on regulatory T cells from solid tumours and peripheral blood. Comprehensively various remarkable characteristics were observed in patients with melanoma or renal cell carcinoma, as promising approaches for further evaluations. Regarding pre-therapeutic markers for prognosis, response to therapy and the occurrence of autoimmune side effects promising candidates have been outlined. Additionally, we provided a stronger basis with optimized methodological criteria for the isolation, further processing and stimulation of tumour-infiltrating lymphocytes. Taking together, this forms an extensive basis for further investigations in larger collectives.