3D-Lungenorganoide als translationales Modell zur Wirkstoffentwicklung und Krankheitsmodellierung chronischer Lungenerkrankungen

Abstract

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung und Mukoviszidose sind durch eine übermäßige Schleimproduktion, eine eingeschränkte mukoziliäre Clearance sowie eine verminderte Regenerationsfähigkeit des respiratorischen Epithels gekennzeichnet. Diese Veränderungen führen im Verlauf zu einem fortschreitenden Verlust der Lungenstruktur und -funktion bei den betroffenen Patienten. Da derzeitige Therapieansätze vor allem symptomorientiert sind und die Krankheitsprogression lediglich verlangsamen, besteht ein hoher Bedarf an innovativen Behandlungsstrategien. Das respiratorische Epithel stellt hierfür ein besonders attraktives Ziel dar. Im Jahr 2021 wurden in Deutschland 1,86 Millionen Versuchstiere, überwiegend Nager, in Tierversuchen eingesetzt. Zusätzlich wurden 644.207 Tiere zur Organ- oder Gewebeentnahme getötet (Bf3R, 2023). Für die Erforschung von Atemwegserkrankungen wurden insgesamt 16.824 Tiere verwendet. Tierversuche sind für die regulatorische Sicherheitsbewertung gesetzlich vorgeschrieben. Laut Tierschutzgesetz (§7 Abs. 1) sind sie jedoch auf ein notwendiges und ethisch vertretbares Maß zu beschränken. Daher ist die Entwicklung menschlicher Zellmodelle unerlässlich, um die Zahl der Tiere zu reduzieren, die Aussagekraft zu erhöhen und den 3R-Prinzipien gerecht zu werden. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von 3D-Lungenorganoid-Plattformen zur Prüfung pharmazeutischer Wirkstoffe im Hinblick auf zelluläre Seneszenz, Entzündungsprozesse und Toxizität. Zur umfassenden Charakterisierung der Modelle kamen moderne Methoden wie die Einzelzellsequenzierung zum Einsatz. In Matrigel differenzierte Organoide wurden mit Doxorubicin, den Senolytika Quercetin und Dasatinib und der Kombination von Doxorubicin mit den Senolytika behandelt. Quercetin und Dasatinib wirkten der Doxorubicin-induzierten β-Galactosidase-Aktivität und der Freisetzung von Zytokinen und Stressfaktoren entgegen, ohne die Integrität der Organoide zu beeinflussen. Die Einzelzellsequenzierung zeigte, dass die Organoide aus (Übergangs-) Basal-, Sekretions-, Becher-, deuterosomalen und Flimmerzellen bestanden. Es wurden seneszenzartige Zellen identifiziert, die durch eine starke Expression der Seneszenzmarker CDKN1A (p21), CDKN2A (p16), TIMP2 und GDF15 und eine erhöhte Aktivität der BATF- und PRDM1-Regulone gekennzeichnet waren. Die Quercetin-Behandlung führte zu einem verringerten Anteil seneszenter Zellen, wohingegen die Doxorubicin-Behandlung zu einem erhöhten Anteil an Becherzellen mit erhöhter Expression von Genen führte, die mit Entgiftung assoziiert sind (z. B. CYP1A1, ALDH1A3). Matrigel wird aus Tumor-belasteten Mäusen gewonnen. Es ist daher wichtig, Matrigel-freie Organoid-Modelle zu entwickeln. Matrigel-freie Apikal-Out-Organoide wurden mit Interleukin-13 während der Differenzierungsphase stimuliert. Dies führte zum Verlust der Organoidmotilität. Histologie, Immunhistochemie, Einzelzellsequenzierung und semiquantitative RT-PCR zeigten, dass Interleukin-13 einen sekretorischen Phänotyp induziert. Dies wurde mittels Proteomanalyse bestätigt. Einzelzellanalysen an Tag 2 und 4 zeigten auf, wie Basalzellen sich über deuterosomale Zellen zu Zilien-Organoiden differenzieren und das Lungenpathogen non-typable Haemophilus influenzae die Expression von Entzündungsmediatoren in Übergangsbasalzellen induziert. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass 3D-Lungenorganoid-Plattformen erfolgreich für präklinische Wirkstofftests etabliert wurden. Im 24- bzw. 96-Well-Format können verschiedene Endpunkte innerhalb eines einzigen Versuchszyklus erfasst werden. Darüber hinaus ermöglichen vielfältige Methoden, wie biochemische Assays und Einzelzellsequenzierungen, weiterführende mechanistische Analysen. Der Einsatz Matrigel-freier Organoide stellt einen bedeutenden Fortschritt im Sinne der 3R-Prinzipien dar und bietet Potenzial für die Anwendung sowohl in der regulatorischen Bewertung als auch in der Grundlagenforschung.

3D lung organoids as a translational model for the development and disease modeling of chronic lung diseases Chronic obstructive pulmonary disease and cystic fibrosis are characterized by excessive mucus production, impaired mucociliary clearance, and reduced regenerative capacity of the respiratory epithelium. These changes lead to a progressive loss of lung structure and function in affected patients. Since current therapeutic approaches are primarily symptom-oriented and only slow disease progression, there is a high demand for innovative treatment strategies. The respiratory epithelium represents a particularly attractive target in this regard. In 2021, 1.86 million laboratory animals, predominantly rodents, were used in animal experiments in Germany. An additional 644,207 animals were killed for organ or tissue harvesting (Bf3R, 2023). A total of 16,824 animals were used for research into respiratory diseases. Animal testing is legally required for regulatory safety assessments. However, according to the Animal Welfare Act (§7 para. 1), it must be limited to what is necessary and ethically justifiable. Therefore, the development of human cell models is essential to reduce the number of animals used, increase the statistical power, and adhere to the 3R principles. The aim of this work was to develop 3D lung organoid platforms for testing pharmaceutical agents with regard to cellular senescence, inflammatory processes, and toxicity. Modern methods such as single-cell sequencing were used for comprehensive characterization of the models. Organoids differentiated in Matrigel were treated with Doxorubicin, the senolytics Quercetin and Dasatinib, and a combination of Doxorubicin and the senolytics. Quercetin and Dasatinib counteracted Doxorubicin-induced β-galactosidase activity and the release of cytokines and stress factors without affecting the integrity of the organoids. Single-cell sequencing revealed that the organoids consisted of (transitional) basal, secretory, goblet, deuterosomal, and ciliated cells. Senescence-like cells were identified, characterized by strong expression of the senescence markers CDKN1A (p21), CDKN2A (p16), TIMP2, and GDF15, and increased activity of the BATF and PRDM1 regulons. Quercetin treatment resulted in a decreased proportion of senescent cells, whereas Doxorubicin treatment led to an increased proportion of goblet cells with enhanced expression of genes associated with detoxification (e.g., CYP1A1, ALDH1A3). Matrigel is derived from tumor-affected mice. Therefore, it is important to develop Matrigel-free organoid models. Matrigel-free apical-out-organoids were stimulated with interleukin-13 during the differentiation phase. This led to a loss of organoid motility. Histology, immunohistochemistry, single-cell sequencing, and semi-quantitative RT-PCR showed that interleukin-13 induces a secretory phenotype. This was confirmed by proteomic analysis. Single-cell analyses on days 2 and 4 revealed how basal cells differentiate into ciliated organoids via deuterosomal cells and how the lung pathogen non-typable Haemophilus influenzae induces the expression of inflammatory mediators in transitional basal cells. In summary, 3D lung organoid platforms have been successfully established for preclinical drug testing. In 24- or 96-well formats, various endpoints can be assessed within a single experimental cycle. Furthermore, diverse methods, such as biochemical assays and single-cell sequencing, enable further mechanistic analyses. The use of Matrigel-free organoids represents a significant advance in line with the 3R principles and offers potential for application in both regulatory assessment and basic research.