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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bsz:291-scidok-9358
URL: http://scidok.sulb.uni-saarland.de/volltexte/2007/935/


Development of procedures for sreening for, identification and/or validated quantification of herbal drugs in blood or urine using GC-MS, LC-MS or LC-MS/MS

Entwicklung von Verfahren zum Sreening, der Identifizierung und/oder validierten Quantifizierung von pflanzlichen Arzneistoffen in Blut oder Urin, unter Verwendung von GC-MS, LC-MS oder LC-MS/MS

Beyer, Jochen

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SWD-Schlagwörter: Identifikation , Quantifizierung , GC-MS , GC-MS
Freie Schlagwörter (Englisch): identification, quantification, GC-MS, LC-MS
Institut: Fachrichtung 2.4 - Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät: Fakultät 2 - Medizin
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Maurer, Hans H. (Univ.-Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 09.01.2007
Kurzfassung auf Englisch: In the presented thesis, procedures are described for screening for, identification and/or validated quantification of herbal drugs in blood or urine using GC-MS, LC-MS or LC-MS/MS. They are needed in in clinical and forensic toxicology, because poisonings with plants or plant ingredients as well as their abuse are widespread. The aims of such an abuse are stimulation, hallucinations, or even for weight loss or habitual use. In both cases, toxicological analysis is the prerequisite for reliable diagnosis, prognosis and monitoring. The following drugs or drugs classes were included in this method development: laxatives, ingredients of nutmeg, herbal phenalkylamines, and toxic alkaloids.
For detection of the acidic laxatives bisacodyldiphenol, phenolphthalein, and rhein in urine, extractive methylation was used. The analytes were derivatized and simultaneously extracted using methyl iodide in toluene and the phase transfer catalyst tetrahexylammonium hydrogen sulfate. The phase transfer catalyst was removed from the organic phase by solid phase extraction. The extracts were analyzed by GC-MS. The developed method allowed the identification and differentiation of stimulant laxatives and/or their metabolites in urine after ingestion of therapeutic doses.
In the study covering the nutmeg ingredients, metabolism and toxicological analysis in urine of elemicin, myristicin, and safrole were investigated. The qualitative metabolism was studied in Wistar rats, that were administered a high dose of the corresponding nutmeg ingredient. The metabolites were identified by GC-MS. The study showed that the nutmeg ingredients were extensively metabolized, and that the parent compounds were not detectable in urine. For toxicological analysis, an established method including acid hydrolysis, liquid-liquid extraction and microwave-assisted acetylation was used. The derivatized metabolites were separated and detected using GC-MS in the full scan mode. Using this procedure, a nutmeg abuse or intoxication can be monitored via detection of the metabolites.
Detection and validated quantification of herbal phenalkylamines ephedrine, pseudoephedrine, norephedrine, norpseudoephedrine, methylephedrine, methylpseudoephedrine, cathinone, mescaline, synephrine (oxedrine), and methcathinone in human plasma were based on a standard solid-phase extraction procedure using mixed-mode SPE columns. The analytes were seperated using a liquid chromatography with a strong cation exchange seperation column as stationary phase, and a gradient elution with 5 mM ammonium formate buffer/acetonitril as mobile phase. The analytes were detected with an LC-ESI-MS/MS operated in the MRM mode. The method allowed the detection of ephedrines after ingestion of therapeutic doses, selective, linear, accurate and precise quantification, as well as the differentiation of an herbal drugs abuse from ingestion of cold remedies.
Detection and validated quantification of the toxic alkaloids aconitine, atropine, colchicine, coniine, cotinine, cytisine, nicotine, physostigmine, scopolamine in human plasma were based on the identical extraction procedure used for the extraction of the herbal phenalkylamines. The analytes were seperated using a liquid chromatography with a C8 base select seperation column as stationary phase, and a gradient elution with 50 mM ammonium formate buffer/acetonitril as mobile phase. The analytes were detected either with an LC-APCI-MS operated in full scan and SIM mode or an LC-ESI-MS/MS operated in the MRM mode. In this study, the use of LC-APCI-MS vs LC-ESI-MS/MS was directly compared. As expected, the tandem MS was more selective and sensitive than the single stage MS. The accuracy and precision data for both apparatus were comparable. In case of poisoning, both apparatus can be used for detection and quantification. Only if low concentration must be monitored tandem MS is needed due to its higher sensitivity.
In summary, all presented methods have proven to be reliable and accurate and are now a valuable tool in clinical and forensic toxicology.
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Dissertation beschreibt Methoden zur Suchanalyse, Identifizierung und/oder validierten Quantifizierung von pflanzlichen Arzneistoffen in Blut oder Urin unter der Verwendung GC-MS, LC-MS oder LC-MS/MS. Diese Methoden werden sowohl in der klinischen wie auch der forensischen Toxikologie aufgrund der Verbreitung von Pflanzenvergiftungen bzw. Vergiftungen mit Pflanzenwirkstoffen sowie deren Missbrauch benötigt. Die Beweggründe eines solchen Missbrauchs sind Stimulation, Halluzinationen, aber auch Gewichtsverlust oder Gewöhnung. Sowohl zur Diagnose eines Missbrauchs als auch einer Vergiftung sind toxikologische Analysen eine Grundvorrausetzung zur zuverlässigen Diagnose, Prognose und Überwachung. Die folgenden Stoffe oder Stoffklassen wurden bei dieser Methodenentwicklung berücksichtigt: Laxanzien, Inhaltsstoffe der Muskatnuss, pflanzliche Phenalkylamine und giftige Alkaloide.
Zum Nachweis der sauren Laxanzien Bisacodyldiphenol, Phenolphthalein und Rhein in Urin wurde die Extraktive Methylierung eingesetzt. Hierbei werden die Analyten durch Methyliodid in Toluol und den Phasentransferkatalysator Tetrahexylammonium-hydrogensulfat derivatisiert und gleichzeitig extrahiert. Der Phasentransferkatalysator wurde aus der organischen Phase mittels Festphasenextraktion entfernt. Die resultierenden Extrakte wurden unter Zuhilfenahme von GC-MS analysiert. Die im Rahmen dieser Dissertation entwickelte Methode erlaubt die Identifizierung und Differenzierung der stimmulierenden Laxanzien und/oder deren Metaboliten nach Einnahme einer therapeutischen Dosis.
Des Weiteren wurde der Metabolismus sowie der toxikologische Nachweis von Elemicin, Myristicin und Safrol, welche Inhaltsstoffe der Muskatnuss sind, untersucht. Die qualitativen Metabolismusuntersuchungen erfolgten an Wistar Ratten, denen eine hohe Dosis der jeweiligen Substanz verabreicht wurde. Die Metaboliten wurden mittels GC-MS identifiziert. Die Untersuchungen zeigten, dass die Inhaltsstoffe der Muskatnuss aufgrund der ausgeprägten Metabolisierung im Urin nicht nachweisbar waren. Als toxikologisches Nachweisverfahren diente in diesem Fall eine etablierte Methode basierend auf einer sauren Hydrolyse zur Konjugatspaltung, Flüssig-Flüssig-Extraktion und Mikrowellenunterstützter Acetylierung. Die derivatisierten Metaboliten wurden mittels GC-MS im full-scan Modus aufgetrennt und detektiert. Diese Methode erlaubt den Nachweis einer Vergiftung sowie Nachweis eines Missbrauchs von Muskatnuss durch Detektion der Metaboliten der Muskatnussinhaltsstoffe.
Die Detektion sowie die validierte Quantifizierung der pflanzlichen Phenalkylamine Ephedrin, Pseudoephedrin, Norephedrin, Norpseudoephedrin, Methylephedrin, Methylpseudoephedrin, Cathinon, Mescalin, Synephrin (Oxedrin) und Methcathinon im Blut basierte auf einer standardmäßig verwendeten Festphasenextraktion unter Zuhilfenahme von Mixed-mode Festphasensäulen. Die Analyten wurden mittels Flüssigchromatographie mit einer starken Kationentauscher-Säule als stationäre Phase und einem Gradientengemisch aus 5 mM Ammoniumformiatpuffer/Acetonitril getrennt. Zur Detektion diente ein LC-ESI-MS/MS, welches im MRM Modus betrieben wurde. Die Methode erlaubt die Detektion der Ephedrine nach Einnahme therapeutischer Dosierungen, die selektive, lineare, richtige und präzise Quantifizierung der genannten Substanzen sowie die Unterscheidung eines Missbrauchs von Pflanzen von der Einahme eines Erkältungsmittels.
Die Detektion sowie die validierte Quantifizierung der giftigen Alkaloide Aconitin, Atropin, Colchicin, Coniin, Cotinin, Cytisin, Nicotin, Physostigmin und Scopolamine im Blut basierten auf der identischen Extraktion wie für die pflanzlichen Phenalkylamine. Die Analyten wurden mittels Flüssigchromatographie mit einer C8 base select-Säule als stationäre Phase und einem Gradientengemisch aus 50 mM Ammoniumformiat-puffer/Acetonitril getrennt. Zur Detektion diente entweder ein LC-APCI-MS, welches im full-scan bzw. im SIM Modus betrieben wurde, oder ein LC-ESI-MS/MS, welches im MRM Modus betrieben wurde. Im Rahmen dieser Untersuchung wurden der verwendete LC-APCI-MS sowie der LC-ESI-MS/MS direkt miteinander verglichen. Wie zu erwarten war der Tandem MS selektiver und empfindlicher als der Single Stage MS. Die Richtigkeits und Präzisionswerte hingegen waren vergleichbar. Zum Nachweis und zur Quantifizierung einer Vergiftung sind beide Geräte geeignet. Wenn allerdings niedrigste Konzentrationen der Stoffe überwacht werden müssen, bedarf es der Benutzung eines Tandem MS aufgrund dessen höherer Sensitivität.
Zusammenfassend lässt sich sagen, daß alle hier präsentierten Methoden zuverlässig und genau sind. Diese Methoden sind ein wertvolles Werkzeug sowohl in der klinischen als auch der forensichen Toxikologie.
Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Dissertationen und Habilitationen der Fakultät 8

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