Untersuchungen zur Regulation des intrazellulären Calciums in Physiologie und Pathophysiologie humaner und muriner Erythrozyten

Abstract

Calcium übernimmt in Erythrozyten, wie auch in vielen anderen Zellen, die wichtige Rolle eines sekundären Botenstoffs. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zum besseren Verständnis dieser Rolle in der Physiologie und Pathophysiologie von Erythrozyten beizutragen. Daher wurden im ersten Teilprojekt dieser Arbeit Untersuchungen gemacht zum intrazellulären Ca2+-Gehalt humaner pathologischer Erythrozyten von Patienten mit seltenen hämolytischen Erkrankungen. Es konnte festgestellt werden, dass Erythrozyten von Patienten mit Hereditärer Sphärozytose, Hereditärer Xerozytose und Gardos-Channelopathie signifikant erhöhte Werte an freiem intrazellulären Calcium im Vergleich zu Erythrozyten gesunder Kontrollblutspendern aufweisen. Für die ebenfalls untersuchten Patienten mit Enzymopathien und uncharakterisierter hämolytischer Anämie wurde keine eindeutige Änderung der Ca2+-Konzentration gefunden. Zusammen mit weiteren Daten aus der Literatur deuten diese Resultate darauf hin, dass ein erhöhter intrazellulärer Ca2+-Gehalt in Erythrozyten ursächlich für den verfrühten Abbau der Zellen in hämolytischen Krankheiten ist. Dieser Mechanismus scheint allgemein gültig sein, wobei sich der Signalweg des Ca2+-Einstroms für jede Erkrankung unterscheidet. Zur Entwicklung neuer Medikamente, die auf eine Inhibition dieses Ca2+-Einstroms als bessere Therapiemöglichkeit anämischer Patienten abzielen, bedarf es jedoch weiterer Forschung. Das zweite Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Lysophosphatidsäure Signalweg, der in murinen und humanen Erythrozyten zu einem Einstrom von extrazellulärem Calcium in die Zellen führt. Diese Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Gehalts steht in Verbindung mit der Aggregation der Erythrozyten als aktiver Teil der Blutgerinnung. Der Lysophosphatidsäure Signalweg ist daher auch zur Behandlung von Thrombosen von pharmakologischem Interesse. Im Detail zeigen die an humanen und murinen Erythrozyten durchgeführten Untersuchungen zum Signalweg, dass die Aktivität des am Signalweg beteiligten TRPC6 Kanals, neben der PKCα, durch einen Komplex aus FKB12 und Calcineurin reguliert wird. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine zusätzliche mechanosensitive Komponente im Signalweg existiert. Ob es sich dabei um den Kanal Piezo1 handelt, muss in weiteren Untersuchungen bestätigt werden. Auf Basis des Lysophosphatidsäure Signalweges wurde im dritten Teilprojekt die Herkunft des TRPC6 Kanals in der Membran von Erythrozyten untersucht. Für humane Erythrozyten lässt sich der Kanal weder auf Proteom- noch Transkriptomebene detektieren. Auch funktionell kann TRPC6 nur in Erythrozyten, nicht in Retikulozyten nachgewiesen werden. Als Hypothese dieses Projekts wurde untersucht, ob es zu einem Transfer des Kanals von anderen Zellen auf Erythrozyten kommt. Dazu wurden Transfusionsversuche von Erythrozyten aus TRPC6 Knockout Mäusen in Wildtyp Mäuse durchgeführt. Anschließend wurde zur Beobachtung eines möglichen Proteinaustauschs der Lysophosphatidsäureinduzierte Ca2+-Einstrom in den transfundierten Erythrozyten untersucht. Als Grundlage hierfür wurden mehrere Ansätze zur Markierung von Erythrozyten vor der Transfusion getestet. Die Methode der in vivo-Biotinylierung zeigte sich nicht als geeignet zur mikroskopischen Detektion markierter Erythrozyten nach Transfusion. Eine Markierung der Zellen mittels Membranfarbstoffen als auch eine endogene Markierung der Zellen durch Expression eines Fluoreszenzproteins waren hingegen erfolgreich. Durchgeführte Transfusionsversuche auf Basis beider Methoden zeigten einen Anstieg des Lysophosphatidsäure-induzierten Ca2+-Einstroms in TRPC6-Knockout Erythrozyten nach Transfusion. Hierdurch kann auf einen Transfer des TRPC6 Kanals in die Membran der Knockout Erythrozyten von Zellen der Wildtyp Maus geschlossen werden. Der Transfer scheint dabei vermehrt oder auschließlich bei Retikulozyten vorzukommen. Eine Beteiligung der Milz an diesem Transfer wurde ebenfalls untersucht, konnte jedoch nicht belegt werden. Zum Ablauf, Ort und weiterem Verständnis des Proteintransfer müssen zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden. Ebenfalls soll die Frage geklärt werden, ob ein Austausch von Proteinen auch bei humanen roten Blutzellen auftritt.

Calcium plays an important role as a second messenger, in red blood cells as well as in many other cell types. The aim of this study was to contribute to a further understanding of this role in the physiology and pathophysiology of red blood cells. In the first part of this thesis, pathologic human red blood cells from patients with rare hereditary anemias were analyzed for their intracellular calcium content. The results of this study showed that red blood cells from patients with hereditary spherocytosis, hereditary xerocytosis and Gardos channelopathy have significantly increased levels of free intracellular calcium in comparison to red blood cells from healthy donors. For patients with enzymopathies and uncharacterized hemolytic anemia there was no clear change in the intracellular calcium. Together with data from the literature, these findings indicate that an increased intracellular calcium content might be responsible for the premature elimination of red blood cells from the blood stream. This mechanism seems to have to a general scope with different pathways of calcium entry in different diseases. More research is needed for the development of drugs aiming on the inhibition of this calcium increase. The second part of this thesis deals with the lysophosphatidic acid signaling pathway, which leads to an uptake of extracellular calcium in human and murine red blood cells. This increase in intracellular calcium is associated with an aggregation of red blood cells as an active part in thrombus formation. The lysophosphatidic acid signaling pathway is therefore also an interesting pharmacological target for the treatment of thrombosis. The results of the experiments on murine and human red blood cells show, that TRPC6, a channel involved in this pathway, is regulated by PKCα and a protein complex consisting of FKB12 and calcineurin. Furthermore, the results hint to the involvement of a mechanosensitive channel in the signaling cascade. To confirm that this channel is Piezo1, further research needs to be done. Based on the lysophosphatidic acid signaling pathway, the origin of the TRPC6 channel in the membrane of red blood cells was explored in the third part of this thesis. For human red blood cells, it was not yet possible to detect the channel on a proteome- or transcriptome level. Functional evidence is also limited to mature red blood cells and missing in reticulocytes. As a hypothesis of this project, a possible transfer of the channel between red blood cells and other cell types was investigated. For this purpose, transfusion experiments of red blood cells from TRPC6 knockout mice to wildtype mice were performed. Subsequently, the lysophosphatidic acid induced calcium entry was analyzed in the transfused cells to visualize the potential transfer of the channel. Beforehand, several methods to label red blood cells for transfusion were tested. The method of in vivo biotinylation was not suitable for the microscopic detection of the cells after transfusion. Labeling the cells with membrane dyes as well as the endogenous expression of a fluorescent protein were successful. The results from the transfusion experiments based on both labeling methods showed an increase in the lysophosphatidic acid induced calcium signal in TRPC6 knockout cells after transfusion. From these results, it can be concluded that there is a transfer of the channel to the membrane of TRPC6 knockout red blood cells from cells of the wildtype mouse. This transfer seems to occur enhanced or exclusively in reticulocytes. The contribution of the spleen in this process was analyzed but could not be proven. More research is needed to resolve further questions, especially whether a transfer of proteins also occurs in human red blood cells.